Ottimizzazione della produzione microbica tramite il controllo della luce

Nei tempi moderni, ci troviamo ad affrontare problemi globali importanti come il cambiamento climatico, i combustibili fossili limitati e una popolazione in crescita. Queste sfide ci spingono a cercare metodi di produzione sostenibili. I microbici, piccole organismi che possono essere ingegnerizzati, mostrano promesse nella creazione di prodotti preziosi da risorse rinnovabili. Possono potenzialmente sostituire l'uso di combustibili fossili nella produzione di chimici, materiali e combustibili, offrendo opzioni più sostenibili.

Per ottenere l'efficienza necessaria per la redditività nella produzione, è essenziale migliorare sia i processi di produzione sia il metabolismo delle cellule microbiche. Fondamentalmente, dobbiamo trovare modi affinché queste cellule producano di più dei prodotti desiderati utilizzando meno risorse. Un termine chiave qui è "resa del prodotto", che indica quanto prodotto può essere realizzato da una certa quantità di materie prime. Un altro concetto importante è "produttività volumetrica", che riguarda la rapidità con cui questi prodotti possono essere prodotti in un certo volume di liquido.

#Approcci tradizionali all'ingegneria genetica

I metodi tradizionali di ingegneria genetica si concentrano sull'aggiustare le vie metaboliche della cellula per massimizzare la resa del prodotto. Questo implica modificare l'impostazione della cellula per dare priorità alla produzione di prodotti piuttosto che alla crescita di più cellule. Tuttavia, questo porta spesso a una diminuzione della produttività volumetrica poiché le risorse vengono deviate verso la creazione di prodotti anziché verso la crescita cellulare. Inoltre, in molti casi, i geni che aiutano a produrre questi prodotti sono sempre accesi a un tasso costante, il che limita la flessibilità.

L'approccio tradizionale all'ingegneria metabolica è piuttosto statico, il che significa che le cellule non si adattano ai cambiamenti nel loro ambiente o ai segnali interni. Anche se queste cellule possono rispondere a segnali esterni e interni, questa reattività non viene utilizzata attivamente per ottimizzare la produzione. A causa di questa mancanza di controllo dinamico, le vie modificate spesso non possono adattarsi alle condizioni che cambiano, rendendole meno efficienti.

#Controllo metabolico dinamico

Un approccio alternativo prevede la progettazione di cellule in grado di esprimere proteine necessarie, come enzimi, in modo più controllato e flessibile. Questo approccio si chiama ingegneria metabolica dinamica e può aiutare a passare tra fasi di crescita e produzione secondo necessità. Una strategia promettente è quella di migliorare il turnover dell'adenosina trifosfato (ATP), che è la valuta energetica nelle cellule.

Nei processi in cui la formazione del prodotto è legata alla produzione di ATP, gestire i livelli di ATP può portare a un miglior output di prodotto e assorbimento delle risorse. Ricerche precedenti hanno suggerito di far rispondere un enzima specifico (ATPasi) alla luce, permettendo di controllare quanto ATP viene prodotto e sprecato manipolando l'esposizione alla luce.

#Studi e modelli precedenti

Studi di simulazione precedenti hanno creato modelli matematici per ottimizzare come utilizzare la luce per controllare l'enzima. Questi modelli miravano a collegare la dinamica delle reazioni metaboliche con la regolazione della luce e delle risorse. Tuttavia, tali modelli possono diventare piuttosto complessi, rendendo difficile implementarli praticamente a causa della necessità di misurazioni e computazioni estensive.

Attraverso il nostro lavoro, ci concentriamo sulla semplificazione di questo processo di modellazione pur catturando le dinamiche essenziali. Proponiamo un modello più semplice che riduce il numero di variabili necessarie per ottimizzare.

#Impianto sperimentale

Nel nostro studio, abbiamo ingegnerizzato E. coli, un batterio comunemente usato nella ricerca, per controllare l'espressione dell'ATPasi attraverso la luce. Il nostro approccio prevedeva un sistema noto come CcaS/CcaR che consente di regolare l'espressione genica cambiando i colori della luce.

L'impianto sperimentale è stato progettato per testare quanto bene funzionasse il nostro modello semplificato per produrre lattato, un prodotto di interesse, in condizioni anaerobiche (il che significa senza ossigeno). I batteri sono stati coltivati in un'incubatrice mentre la luce veniva utilizzata per gestire la produzione di ATP.

#Processo di ingegneria genetica

La ceppo utilizzato nei nostri esperimenti è stato modificato per bloccare certe vie, indirizzando effettivamente il processo di Fermentazione verso la produzione di lattato. Questo ha comportato l'inserimento di geni specifici che consentivano al sistema CcaS/CcaR di funzionare efficacemente in E. coli.

In breve, abbiamo trasformato i batteri per includere geni necessari per la rilevazione della luce e la produzione di ATPasi. I passaggi includevano la modifica dei cromosomi dei batteri e l'introduzione di plasmidi, che sono piccoli pezzi circolari di DNA che portano i geni necessari per le funzioni desiderate.

#Esperimenti di fermentazione

Gli esperimenti di fermentazione sono stati condotti in un ambiente controllato. I batteri sono stati coltivati in un mezzo ricco di nutrienti e coltivati sotto condizioni di luce specifiche per garantire che l'espressione dell'ATPasi potesse essere controllata in modo accurato.

Abbiamo preso campioni a intervalli regolari per misurare le concentrazioni di glucosio, lattato e biomassa. I dati raccolti erano essenziali per regolare i nostri modelli per riflettere come i batteri reagivano ai cambiamenti nella luce e nella disponibilità di nutrienti.

#Modellazione del processo di fermentazione

Il nostro approccio di modellazione mirava a catturare le dinamiche non solo della produzione di lattato, ma anche della crescita di E. coli e del consumo di glucosio. Abbiamo considerato vari stati, comprese le concentrazioni di glucosio, lattato e biomassa.

Sembrando il modello, abbiamo ridotto le complessità presenti negli approcci precedenti, che potrebbero coinvolgere dozzine di variabili. Il nostro modello si è concentrato sugli aspetti più significativi del processo di fermentazione, principalmente su come gli input di luce influenzassero i livelli di ATPasi, che a loro volta influenzavano la resa del prodotto.

#Validazione del modello

Per garantire che il nostro modello fosse accurato, abbiamo condotto diversi esperimenti di fermentazione con diversi livelli di input di luce. Confrontando i risultati previsti dal nostro modello con quelli effettivi, siamo stati in grado di valutare quanto bene il modello si comportava in condizioni reali.

I risultati hanno mostrato una correlazione tra l'aumento dell'intensità della luce e la produzione di lattato, confermando che il nostro modello poteva prevedere ragionevolmente le dinamiche di fermentazione.

#Ottimizzazione in anello aperto

Abbiamo formulato problemi di ottimizzazione per determinare le migliori condizioni per massimizzare la produzione di lattato in base ai nostri modelli. Questo ha comportato l'impostazione di vincoli sulle concentrazioni iniziali di glucosio e garantire che tutto il glucosio fosse consumato entro la fine del processo di fermentazione.

Regolando l'input di luce nel tempo, miravamo a trovare un equilibrio tra la massimizzazione delle rese di lattato e la gestione della crescita della biomassa. L'ottimizzazione ha fornito intuizioni su come i batteri potessero essere manipolati per ottenere risultati migliori.

#Implementazione sperimentale delle ottimizzazioni

Dopo le nostre ottimizzazioni predittive, ci siamo proposti di convalidarle attraverso esperimenti reali. I risultati di questi esperimenti si sono avvicinati molto alle nostre previsioni, dimostrando la robustezza del nostro approccio di modellazione semplificato.

Sebbene abbiamo osservato alcune discrepanze tra le nostre previsioni e i risultati effettivi, la tendenza complessiva seguiva ciò che ci aspettavamo. Gli esperimenti hanno illustrato come il controllo dinamico dell'espressione di ATPasi possa migliorare i risultati nei processi di fermentazione.

#Direzioni future

Anche se il nostro studio ha convalidato con successo il nostro modello e le strategie di ottimizzazione, c'è ancora margine di miglioramento. Il disallineamento modello-impianto che abbiamo riscontrato suggerisce che i metodi di controllo retroattivo potrebbero migliorare l'efficienza del sistema.

Implementare un sistema di controllo in anello chiuso che si regola in tempo reale sulla base delle misurazioni dal processo di fermentazione consentirebbe una gestione più reattiva delle condizioni. Tali sviluppi potrebbero portare a sistemi di fermentazione più intelligenti in grado di adattarsi alle fluttuazioni sia nei processi biologici che nei fattori ambientali.

Inoltre, esplorare ulteriori tecniche di modellazione, come combinare l'analisi del bilancio di flusso con approcci di machine learning, potrebbe migliorare la prevedibilità dei modelli futuri. Integrando conoscenze da varie strategie di modellazione, potremmo affinare i nostri approcci per risultati ancora migliori.

#Conclusione

In sintesi, il nostro studio presenta un metodo innovativo per ottimizzare l'espressione dell'ATPasi in E. coli attraverso la regolazione della luce, supportato da una validazione sperimentale. Semplificando il processo di modellazione e implementando l'ottimizzazione in anello aperto, abbiamo dimostrato una strategia efficace per migliorare la produzione di lattato.

Le nostre scoperte contribuiscono alla comprensione del controllo metabolico dinamico nei processi di fermentazione microbica e aprono percorsi per sviluppi futuri in metodi di produzione sostenibili. In definitiva, il nostro lavoro mostra il potenziale dei microrganismi ingegnerizzati nell'affrontare importanti sfide globali mentre si promuovono pratiche industriali più sostenibili.