Progressi nella ricerca sui cardiomiociti usando hiPSC-CMs

Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di malattia e morte in tutto il mondo, causando circa 18 milioni di morti ogni anno. Il cuore è composto da diversi tipi di cellule, tra cui i cardiomiociti, che sono i più abbondanti. Negli adulti, queste cellule sono disposte in un modo che aiuta il cuore a pompare il sangue in modo efficace. I cardiomiociti adulti hanno una forma e una struttura specifiche che permettono loro di funzionare correttamente. Tuttavia, studiare queste cellule direttamente dai cuori umani presenta delle sfide, come la disponibilità limitata e le difficoltà nella loro manutenzione in laboratorio.

Per superare queste sfide, gli scienziati usano un tipo di cellula chiamata HiPSC-CM, derivata da cellule staminali umane. Queste cellule possono essere coltivate in grandi quantità e forniscono preziose informazioni sulle malattie cardiache e potenziali nuovi trattamenti. Tuttavia, gli hiPSC-CM sono meno maturi dei cardiomiociti adulti e hanno proprietà diverse. I ricercatori stanno lavorando per creare ambienti migliori per la crescita di queste cellule in laboratorio, che assomigliano alle condizioni di un cuore sano.

#Creare l'ambiente giusto

Un setup ideale per la crescita dei cardiomiociti prevede l'uso di un Substrato che imita la consistenza e la Rigidità del tessuto cardiaco. Questo substrato dovrebbe supportare l'attacco e la crescita dei cardiomiociti, aiutarli ad allinearsi correttamente e accogliere il movimento naturale del cuore. La rigidità del substrato dovrebbe corrispondere a quella del tessuto cardiaco sano, che varia tra 1-6 kPa nei cuori giovani e 10-15 kPa nei cuori adulti sani.

Per produrre tali substrati, i ricercatori hanno impiegato varie tecniche, tra cui la litografia soft e la microfabbricazione. Un materiale popolare per la realizzazione di questi substrati è il polidimetilsilossano (PDMS), noto per la sua stabilità, biocompatibilità e basso costo. Anche se il PDMS ha molti vantaggi, può essere difficile per i cardiomiociti aderire alla sua superficie perché il PDMS è naturalmente idrofobo.

Per migliorare l'attaccamento cellulare, i ricercatori hanno sviluppato metodi per modificare la superficie del PDMS, rendendola più adatta alla crescita delle cellule. Queste modifiche includono il rivestimento della superficie con proteine che aiutano le cellule ad aderire meglio.

#Metodi di fabbricazione

Il processo per creare il substrato micropatterned morbido prevede diversi passaggi. Prima, viene realizzato uno stampo utilizzando il PDMS, che richiede una incisione attenta per formare scanalature. Queste scanalature guidano le cellule a crescere nella direzione desiderata. Una volta che lo stampo è pronto, viene applicato uno strato di un materiale chiamato alcol polivinilico (PVA) per facilitare la rimozione del substrato di PDMS in seguito.

Successivamente, una versione più morbida del PDMS viene versata nello stampo. Dopo, il substrato viene trattato per migliorare le sue proprietà superficiali prima di essere utilizzato per la coltura cellulare. I ricercatori utilizzano varie tecniche per garantire che la profondità e la spaziatura delle scanalature siano costanti, poiché queste caratteristiche influenzano come le cellule crescono e si comportano.

#Caratterizzazione del substrato

Per garantire che i substrati siano adatti per la coltura dei cardiomiociti, i ricercatori misurano aspetti come la profondità delle scanalature e la texture della superficie. Queste caratterizzazioni aiutano a capire come il substrato possa influenzare la crescita e la funzione cellulare.

Effettuano anche test per misurare la rigidità dei substrati, poiché diversi livelli di rigidità possono creare risposte diverse nelle cellule. Questa caratterizzazione meccanica è essenziale perché aiuta a prevedere come le cellule risponderanno al substrato durante gli esperimenti.

#Migliorare l'attaccamento cellulare

L'attaccamento delle cellule al substrato è fondamentale per studi di successo sui cardiomiociti. I ricercatori misurano quanto bene le cellule si attaccano a diversi tipi di substrati. Scoprono che i substrati trattati con rivestimenti specifici, come le proteine, migliorano significativamente la capacità delle cellule di attaccarsi e crescere.

Un approccio di successo è stato quello di applicare una combinazione di PD e proteine della matrice extracellulare (ECM). Trattare il substrato in questo modo permette ai cardiomiociti di formare uno strato monostrato stabile e funzionale. Questo strato è cruciale per indagare la loro attività elettrica e il comportamento contrattile.

#Differenziare le cellule staminali in cardiomiociti

Per produrre cardiomiociti, i ricercatori li derivano da hiPSC. Queste cellule staminali subiscono una serie di passaggi, iniziando ad essere piantate su una superficie rivestita con proteine speciali per supportare la loro crescita. Dopo un po', il mezzo viene cambiato per incoraggiare le cellule a iniziare a differenziarsi in cardiomiociti. Le cellule raggiungono uno stato di maturità dopo alcuni giorni, mostrando caratteristiche simili a quelle trovate nelle cellule cardiache adulte.

Durante questo processo di differenziazione, gli scienziati monitorano attentamente le cellule per assicurarsi che si sviluppino correttamente. L'obiettivo è ottenere un'alta purezza di cardiomiociti, il che consente risultati più affidabili nei successivi esperimenti.

#Effetti delle caratteristiche del substrato sul comportamento cellulare

I ricercatori indagano come le caratteristiche del substrato micropatterned, come le dimensioni delle scanalature, influenzano i cardiomiociti. Esaminano come le diverse dimensioni dei pattern influenzano l'allineamento delle cellule e dei loro nuclei. Una scoperta cruciale è che specifici parametri, come la profondità delle scanalature e la spaziatura, promuovono un migliore allineamento e funzionalità dei cardiomiociti.

Negli esperimenti, i ricercatori osservano che le migliori prestazioni si verificano con determinate dimensioni dei micropattern. Le cellule coltivate su questi pattern ottimali mostrano un'organizzazione e una funzione migliorate, riflettendo più da vicino il comportamento dei cardiomiociti adulti.

#Maturazione dei cardiomiociti

Coltivare cardiomiociti derivati da hiPSC su substrati appositamente progettati consente ai ricercatori di favorire ulteriormente la maturazione. Osservano cambiamenti nel tempo in proprietà come l'organizzazione dei sarcomeri, la forza contrattile e la gestione del calcio.

Dopo alcune settimane sul substrato micropatterned morbido, i cardiomiociti mostrano un'organizzazione strutturale migliorata. Questa maturazione è indicata da lunghezze e orientamenti dei sarcomeri migliori, essenziali per una funzione cardiaca efficace. I ricercatori notano anche che la capacità delle cellule di gestire il calcio migliora, portando a una migliore contrattilità.

#Valutazione della funzionalità

La funzionalità dei cardiomiociti coltivati viene valutata utilizzando varie tecniche. Analizzando i tassi di contrazione e rilassamento, i ricercatori determinano quanto bene queste cellule imitano il comportamento delle cellule cardiache adulte. I test misurano parametri come l'accorciamento dei sarcomeri e le dinamiche dei transienti di calcio, fornendo informazioni sulle prestazioni complessive delle cellule.

Queste valutazioni sono cruciali per capire quanto bene le cellule coltivate possano essere utilizzate per studiare le malattie cardiache o per testare nuovi farmaci.

#Coltivazione a lungo termine

Un aspetto essenziale della ricerca è la capacità di coltivare cellule per periodi prolungati, a volte oltre i tre mesi. Le osservazioni a lungo termine aiutano gli scienziati a capire come i cardiomiociti cambiano nel tempo e come le loro funzioni possono essere influenzate dal microambiente.

Durante studi a lungo termine, i ricercatori monitorano cambiamenti nella struttura e nella funzione cellulare, identificando punti di maturazione e segni di dedifferenziazione. Questa conoscenza è fondamentale per stabilire modelli stabili per studiare le malattie cardiache e le risposte ai farmaci.

#Sviluppo di tecniche utili

Nel corso dello studio, vengono sviluppate varie tecniche e procedure per creare ambienti efficaci per la coltura dei cardiomiociti. Questi metodi consentono ai ricercatori di produrre modelli cellulari stabili e funzionali che possono fornire informazioni sullo sviluppo cardiaco, le malattie e le potenziali terapie.

Un progresso chiave è la capacità di creare substrati micropatterned in modo semplice senza la necessità di strutture cleanroom complesse. Questa accessibilità incoraggia ulteriori sperimentazioni e innovazioni nel campo.

#Direzioni future

In futuro, i ricercatori pianificano di ampliare la propria comprensione esaminando come diversi fattori ambientali impattino il comportamento dei cardiomiociti. Si concentra sull'esplorazione di strutture 3D, che potrebbero imitare meglio le condizioni trovate nel tessuto cardiaco reale.

Inoltre, indagare sull'espressione proteica nelle cellule staminali e nei cardiomiociti potrebbe offrire spunti su come queste cellule si adattano a vari ambienti. Tali studi sono essenziali per far avanzare il campo della medicina rigenerativa e migliorare il trattamento delle condizioni cardiache.

#Conclusione

Questa ricerca sottolinea l'importanza di creare ambienti ottimali per gli hiPSC-CM per migliorare la loro maturazione e funzionalità. Sviluppando nuovi substrati micropatterned con proprietà meccaniche specifiche, gli scienziati hanno aperto la strada a nuove tecniche nello studio delle malattie cardiache e nella sperimentazione di potenziali trattamenti.

La capacità di coltivare cellule per periodi prolungati mantenendo la funzionalità è un significativo progresso. Questo lavoro ha un potenziale per future applicazioni nell'ingegneria dei tessuti cardiaci e nella scoperta di farmaci, contribuendo infine a risultati migliori per i pazienti con condizioni cardiache.