Approfondimenti sulla dinamica dei GPCR e sviluppo di farmaci

I recettori accoppiati alle proteine G (GPCR) sono proteine fondamentali che si trovano sulla superficie delle cellule. Sono coinvolti in molte funzioni biologiche importanti nel nostro corpo, come la vista, l'olfatto, la percezione del dolore e anche nella lotta contro le malattie. Ci sono circa 800 diversi GPCR negli esseri umani. Quando questi recettori non funzionano correttamente o hanno mutazioni, possono portare a varie malattie, come l'Alzheimer, l'ipertensione, l'asma e il diabete.

Data la loro importanza, i GPCR sono spesso mirati nello sviluppo di farmaci. Infatti, una grande parte dei medicinali approvati dalla FDA negli Stati Uniti mira specificamente ai GPCR.

#Struttura dei GPCR

Tutti i GPCR hanno una struttura simile. Sono composti da sette segmenti che attraversano la membrana cellulare, chiamati eliche α-transmembrana (TM1-TM7). Questi segmenti sono collegati da anelli all'esterno e all'interno della cellula. La parte esterna del recettore può legarsi a diverse molecole, mentre la parte interna interagisce con altre proteine per inviare segnali all'interno della cellula.

#Come funzionano i GPCR

L'attivazione dei GPCR avviene quando ricevono segnali dall'esterno della cellula. Questi segnali possono provenire dalla luce, dagli ormoni o da altre sostanze attivanti. Quando un GPCR viene attivato, interagisce con un gruppo speciale di proteine chiamate proteine G, che svolgono un ruolo vitale nella trasmissione del segnale all'interno della cellula.

Le proteine G sono composte da tre unità: alfa (Gα), beta (Gβ) e gamma (Gγ). Ci sono diversi tipi di proteine G in base alle loro unità Gα, e funzionano passando da stati attivi a inattivi, il che è cruciale per il processo di segnalazione.

Quando i GPCR vengono attivati, l'unità Gα rilascia una molecola chiamata GDP e prende un'altra molecola chiamata GTP. Questo cambiamento nell'unità Gα le permette di separarsi dalle altre due unità e interagire con varie proteine, influenzando molte funzioni cellulari.

#Importanza dello studio dei GPCR

Capire come funzionano i GPCR a livello strutturale aiuta gli scienziati a capire come trasmettono segnali e sviluppare nuovi farmaci per mirare a questi recettori. Alcune tecniche usate per studiare i GPCR includono la cristallografia a raggi X, la criomicroscopia elettronica (Cryo-EM) e la risonanza magnetica nucleare (NMR). Questi metodi permettono ai ricercatori di ottenere immagini dettagliate e informazioni sui GPCR in diversi stati.

Nel 2011, i ricercatori sono riusciti a catturare la prima struttura di un GPCR che interagisce con una Proteina G, fornendo importanti informazioni sulla segnalazione dei GPCR. Tuttavia, molte delle immagini catturate mostrano solo stati stabili e non rivelano l'intera gamma di movimenti e cambiamenti che queste proteine subiscono.

Negli ultimi 20 anni, la spettrometria di massa (MS) è emersa come uno strumento prezioso per studiare la dinamica dei GPCR. Questa tecnica misura come le proteine cambiano nel tempo, aiutando a identificare come diversi ligandi influenzano il loro comportamento.

Un approccio promettente nell'uso della spettrometria di massa è la spettrometria di massa per scambio di idrogeno-deuterio (HDX-MS). Questo metodo permette ai ricercatori di seguire il movimento delle proteine mentre interagiscono con altre molecole, fornendo informazioni vitali sulla dinamica e sui processi coinvolti.

#Indagare GPBAR1 e complesso Gs

Nel nostro studio, ci siamo concentrati su un GPCR specifico chiamato GPBAR1, che è un recettore coinvolto nella regolazione dell'energia e del metabolismo. Abbiamo osservato GPBAR1 quando era legato al suo ligando attivo, P395, e interagiva con un tipo di proteina G chiamata Gs. Questa interazione gioca un ruolo nella prevenzione del diabete e nella riduzione dell'infiammazione, rendendo GPBAR1 un obiettivo promettente per nuovi trattamenti.

Utilizzando cryo-EM, abbiamo ottenuto una struttura dettagliata del complesso GPBAR1/Gs a una risoluzione di 2.5 Å. Abbiamo anche usato HDX-MS per analizzare i movimenti e i cambiamenti sia in GPBAR1 che nella proteina G durante la loro interazione.

#Purificazione del complesso GPBAR1/G

Per condurre i nostri esperimenti, prima abbiamo dovuto creare un complesso GPBAR1/Gs funzionale. Questo è stato fatto esprimendo la proteina GPBAR1 insieme alle sottounità della proteina G in cellule di insetto. Dopo che le proteine sono state prodotte, sono state purificate e stabilizzate con il ligando P395 e un anticorpo speciale noto come Nb35.

Abbiamo utilizzato la fotometria di massa, una tecnica che misura la massa delle proteine, per valutare la purezza e l'omogeneità del nostro complesso GPBAR1/Gs. I risultati hanno indicato la presenza del complesso desiderato insieme ad alcune specie minori a causa dell'aggregazione delle proteine.

#Analisi HDX-MS del complesso GPBAR1/Gs

Per capire come cambia e interagisce il complesso GPBAR1/Gs, abbiamo impiegato HDX-MS. L'ottimizzazione delle condizioni di HDX è stata fondamentale per garantire che potessimo tracciare molti peptidi e ottenere una visione completa della dinamica proteica.

L'ottimizzazione ha portato all'identificazione di un gran numero di peptidi che coprono oltre il 99% della sequenza proteica di GPBAR1. Abbiamo scoperto che quando GPBAR1 interagiva con Gs, molte delle sue regioni diventavano più stabili, indicando che il legame di Gs aiuta a bloccare GPBAR1 in una forma specifica.

In particolare, abbiamo notato cambiamenti significativi nelle regioni TM7 e TM5, che mostrano un aumento marcato nell'assorbimento di deuterio, suggerendo che queste aree sono molto dinamiche e svolgono un ruolo importante nell'attivazione dei GPCR.

#Dinamica delle sottounità delle proteine G

Abbiamo anche analizzato come le singole sottounità delle proteine G (Gαs, Gβ e Gγ) reagissero durante l'interazione con GPBAR1. I nostri risultati indicavano che le diverse sottounità hanno livelli variabili di flessibilità quando sono legate a GPBAR1. Notabilmente, Gαs mostrava notevoli cambiamenti, mentre Gγ rimaneva per lo più invariato.

Questa differenza nella dinamica suggerisce che il legame di GPBAR1 a Gαs porta a importanti cambiamenti conformazionali, facilitando il processo di segnalazione.

#Struttura cryo-EM del complesso GPBAR1/G

Oltre all'HDX-MS, abbiamo ottenuto immagini cryo-EM del complesso GPBAR1/Gs. La struttura ad alta risoluzione ha rivelato parti chiave di GPBAR1 e come interagiscono con Gs. La struttura centrale ha fornito intuizioni sulla posizione del ligando e sulle regioni critiche coinvolte nell'interazione tra GPBAR1 e Gs, rafforzando le osservazioni fatte con l'HDX-MS.

#Combinare tecniche per migliori intuizioni

Integrando HDX-MS e cryo-EM, abbiamo acquisito una comprensione più profonda delle interazioni molecolari all'interno del complesso GPBAR1/Gs. I dati dall'HDX-MS si allineavano bene con i dettagli strutturali ottenuti dalla cryo-EM, fornendo un quadro più chiaro di come GPBAR1 e la sua proteina G partner interagiscano.

Ad esempio, abbiamo identificato residui specifici in GPBAR1 che interagiscono direttamente con la sottounità Gαs. I risultati indicavano che il legame a Gs aiuta a stabilizzare GPBAR1, riducendo la sua flessibilità e modificando la dinamica della proteina G.

#Conclusioni

Combinare tecniche all'avanguardia come la fotometria di massa, l'HDX-MS e la cryo-EM ci ha permesso di indagare a fondo il complesso GPBAR1/Gs. Lo studio evidenzia la natura dinamica delle interazioni dei GPCR e la loro importanza per la segnalazione cellulare. I nostri risultati contribuiscono a una migliore comprensione di come funzionano i GPCR, il che potrebbe portare allo sviluppo di terapie più mirate per varie malattie.

In futuro, questo approccio completo può essere applicato ad altri GPCR e ai loro partner di segnalazione, fornendo nuove intuizioni sui meccanismi di attivazione e funzione dei GPCR. Migliorando la nostra comprensione di queste interazioni, i ricercatori potrebbero sviluppare trattamenti efficaci che mirano a percorsi specifici correlati ai GPCR, potenzialmente beneficiando molti pazienti in tutto il mondo.