Nuove scoperte sulla modifica m6Am nell'mRNA

I nucleotidi modificati giocano un ruolo fondamentale nella funzione dell'mRNA, la molecola che porta le informazioni genetiche per la produzione di proteine nelle cellule. Uno dei nucleotidi modificati più comuni nell'mRNA si chiama m6Am (N6,2’-O-dimetiladenosina). Questa modifica speciale si trova proprio all'inizio dell'mRNA, noto come nucleotide di inizio trascrizione (TSN). Il TSN corrisponde a una posizione nel DNA dove inizia la trascrizione.

Quando un gene viene trascritto in mRNA, il TSN di solito riceve una modifica chiamata modifica 2’-O-metil. Questa alterazione viene aggiunta da un enzima chiamato CMTR1. Se il TSN è un adenina, può verificarsi un'ulteriore modifica quando un altro enzima chiamato PCIF1 aggiunge un gruppo metile, risultando in m6Am.

Le ricerche hanno dimostrato che m6Am è importante per il funzionamento delle cellule. Per esempio, le cellule normali non sembrano crescere più lentamente quando mancano di PCIF1. Tuttavia, sotto stress ossidativo, la mancanza di PCIF1 può ostacolare la crescita cellulare. Nelle cellule cancerose, soprattutto durante alcuni trattamenti, l'assenza di PCIF1 può portare a tassi di morte cellulare più alti. Inoltre, quando si verificano infezioni virali, l'esaurimento di PCIF1 può aumentare la replicazione dell'HIV e influenzare altri virus.

Date le importanza di m6Am, gli scienziati hanno cercato di identificare e studiare gli mRNA che contengono questa modifica. Studi iniziali hanno indicato che gli mRNA possono esistere in forma m6Am o in una forma non modificata chiamata Am (2’-O-metiladenosina), con Am che è più comune. Per identificare i geni modificati da m6Am, sono stati sviluppati diversi metodi nel corso degli anni. Tuttavia, nonostante numerosi studi che mappano queste modifiche attraverso vari trascritti, l'impatto preciso di m6Am sull'mRNA rimane poco chiaro.

#La Sfida nella Comprensione di m6Am

Una delle principali sfide nella comprensione di m6Am riguarda il modo in cui sono stati caratterizzati i geni. Studi di mappatura precedenti hanno trattato m6Am come se funzionasse come altri nucleotidi modificati all'interno dell'mRNA. Tuttavia, essendo m6Am all'inizio del trascritto, è influenzato dai modi diversi in cui un gene può essere espresso, portando a vari isoformi di trascritti che iniziano in punti diversi. Questo significa che molti geni non hanno un singolo nucleotide di inizio, rendendo difficile assegnare uno specifico stato di modifica basato su studi precedenti.

Inoltre, questi studi hanno classificato ogni gene come se avesse m6Am o meno. Questa classificazione binaria non tiene conto della possibilità che alcuni trascritti possano avere livelli variabili di m6Am, con alcuni contenenti m6Am mentre altri contengono Am. Questa mancanza di sfumature può portare a conclusioni errate sul ruolo di m6Am.

Va anche notato che m6Am è prevalente negli RNA nucleari piccoli (snRNA), che sono coinvolti nel processo di splicing. Inizialmente, si pensava che la maggior parte degli snRNA iniziasse con Am. Tuttavia, studi successivi hanno rivelato che un numero significativo di questi snRNA contiene anche m6Am, che viene poi demetilato a Am da un altro enzima chiamato FTO.

#CROWN-seq: Un Nuovo Metodo per Mappare m6Am

Per comprendere meglio la distribuzione e l'impatto di m6Am, i ricercatori hanno sviluppato un nuovo metodo noto come CROWN-seq. Questa tecnica consente agli scienziati di mappare con precisione i TSN di tutti gli isoformi di trascritti 5’ e quantificare i livelli di m6Am presenti in quei siti.

CROWN-seq è unico perché arricchisce i segnali dai TSN analizzando selettivamente le estremità dell'mRNA. Durante il CROWN-seq, un trattamento chimico converte Am in una forma diversa, consentendo ai ricercatori di determinare se il TSN è modificato come m6Am o rimane come Am. Questo viene fatto separando i trascritti con cappuccio m7G e quantificando i livelli di m6Am presenti in ciascun sito di inizio attraverso vari tipi di cellule.

I risultati del CROWN-seq hanno rivelato una significativa diversità di TSN tra i geni, dimostrando che molti geni non possono essere caratterizzati con precisione da un singolo nucleotide di inizio trascrizione. La ricerca ha mostrato che quasi tutti gli isoformi di trascritti iniziati con A hanno un'alta stechiometria di m6Am, il che significa che m6Am è la forma prevalente all'inizio delle trascrizioni in questi casi.

#Risultati sulla Distribuzione e i Livelli di m6Am

Il metodo CROWN-seq ha identificato un totale di 219.195 TSN, di cui 92.278 sono stati identificati come A-TSN attraverso linee cellulari umane multiple. Questa mappatura estesa indica l'alta prevalenza di m6Am nell'mRNA, in contrasto con le precedenti assunzioni basate su metodi meno accurati.

I dati suggeriscono che m6Am è per lo più associato a livelli più alti di espressione genica, con trascritti che iniziano con m6Am che appaiono più frequentemente di quanto precedentemente riconosciuto. Gli effetti dei vari livelli di m6Am sono stati notevolmente diversi attraverso vari meccanismi di trascrizione. In particolare, alcuni motivi nelle regioni del promotore dei geni sono correlati ai livelli di m6Am, suggerendo che la presenza di m6Am possa migliorare la trascrizione.

#La Relazione tra m6Am e Trascrizione

Una delle rivelazioni intriganti della ricerca è la connessione diretta tra m6Am e l'attività trascrizionale. Maggiore stechiometria di m6Am nei trascritti era generalmente legata a livelli aumentati di espressione genica. Questa relazione solleva domande su se m6Am agisca come un fattore stabilizzante negli mRNA o se abbia un ruolo distinto nel processo di inizio trascrizione.

Lo studio ha trovato che gli A-TSN con livelli più alti di m6Am hanno subito una significativa diminuzione dell'espressione quando l'enzima PCIF1 è stato eliminato. Al contrario, gli A-TSN con livelli più bassi di m6Am hanno mostrato minime variazioni nell'espressione. Questo suggerisce una potenziale dipendenza da m6Am per i meccanismi di trascrizione che coinvolgono specifici motivi del promotore.

#Osservazioni in Vari Tipi di Cellule

I ricercatori hanno anche investigato la stechiometria di m6Am in nove diverse linee cellulari, osservando alti livelli in generale. Mentre l'espressione di PCIF1 era correlata con i livelli di m6Am in una certa misura, anche le linee cellulari con bassa espressione di PCIF1 mostravano ancora alta stechiometria di m6Am. Questa osservazione indica che fattori diversi da PCIF1 potrebbero contribuire alla regolazione di m6Am nell'mRNA.

Oltre agli mRNA, il CROWN-seq ha anche quantificato i livelli di m6Am in snRNA e snoRNA. Curiosamente, i risultati hanno mostrato che gli snRNA avevano un profilo diverso di modifiche di m6Am, con livelli generalmente più bassi e più variabilità tra le diverse linee cellulari rispetto all'mRNA.

#Il Ruolo di FTO nella Regolazione di m6Am

I risultati evidenziano il ruolo di FTO, un enzima che demetila m6Am, nel controllo dei livelli di m6Am in snRNA e snoRNA. La ricerca ha indicato che l'espressione di FTO è negativamente correlata con i livelli di m6Am, il che significa che livelli più elevati di FTO portano a livelli più bassi di m6Am. Quando FTO è stato eliminato, i livelli di m6Am negli snRNA sono aumentati significativamente, dimostrando che FTO è un regolatore principale.

Sebbene FTO giochi un ruolo critico negli snRNA, il suo effetto su m6Am nell'mRNA è stato minimo, suggerendo che m6Am potrebbe essere regolato da meccanismi diversi in questi due tipi di RNA.

#Conclusione: Una Nuova Prospettiva su m6Am nell'mRNA

L'introduzione del CROWN-seq ha fornito una visione più chiara del panorama di m6Am nell'mRNA. Studi precedenti si basavano pesantemente sull'idea che i geni potessero essere rappresentati da un singolo TSN, portando a potenziali inesattezze nella mappatura di m6Am. CROWN-seq affronta queste questioni mappando tutti i siti di inizio e misurando i livelli di m6Am in modo quantitativo.

La ricerca sottolinea l'importanza di m6Am nell'inizio della trascrizione piuttosto che nella stabilità. La correlazione di m6Am con un aumento dell'abbondanza dei trascritti suggerisce che potrebbe servire ruoli specifici di regolazione associati a meccanismi di trascrizione guidati dalla sequenza del promotore centrale.

In futuro, ulteriori studi sono necessari per esplorare appieno le funzioni di m6Am e le sue interazioni con vari percorsi cellulari, incluso come potrebbe influenzare la funzione di snRNA e snoRNA. La relazione tra m6Am e l'inizio della trascrizione potrebbe avere profonde implicazioni per la nostra comprensione della regolazione genica e dell'espressione in tutte le cellule.