Avanzare la genetica batterica con il metodo mbPE
Una nuova tecnica migliora l'editing genetico nei batteri per vari usi.
Jan-Willem Veening, M. Rengifo-Gonzalez, M.-V. Mazzuoli, A. B. Janssen, A.-S. Rueff, X. Liu
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Indice
- Capire CRISPR/Cas9
- La Sfida con Alcuni Batteri
- Prime Editing: Un Nuovo Metodo
- Introdurre il Make-or-Break Prime Editing (mbPE)
- Come Funziona mbPE
- Efficacia dell'mbPE nei Batteri
- Progettare gli Strumenti Giusti
- Testare Modifiche Multiple
- Applicazioni nel Mondo Reale
- Strumenti per l'Ingegneria Genetica
- Esplorare le Interazioni Genetiche
- Prospettive Future con l'mbPE
- Conclusione
- Fonte originale
- Link di riferimento
I batteri sono piccolissime cose vive che si trovano ovunque. Giocano un ruolo importante nelle nostre vite, sia in modo positivo che negativo. Alcuni batteri ci aiutano a digerire il cibo, mentre altri possono farci ammalare. Gli scienziati hanno cercato di cambiare il patrimonio genetico dei batteri per capirli meglio e usarli per scopi positivi, come produrre medicinali o smaltire rifiuti. Uno dei metodi interessanti sviluppati per cambiare il DNA dei batteri si chiama CRISPR/Cas9.
Capire CRISPR/Cas9
CRISPR/Cas9 è uno strumento che gli scienziati usano per modificare i geni. Funziona come un paio di forbici che possono tagliare il DNA in punti specifici. Una volta che il DNA è tagliato, i batteri possono ripararsi da soli, oppure gli scienziati possono inserire nuovi pezzi di DNA per cambiare il codice genetico. Questo metodo è utile, ma può essere lento e complicato, specialmente con alcuni tipi di batteri che sono difficili da modificare.
La Sfida con Alcuni Batteri
Alcuni batteri, come Staphylococcus aureus e Clostridium, sono duri da alterare usando metodi normali. Gli scienziati devono spesso seguire molti passaggi per ottenere i cambiamenti desiderati, e questo può richiedere molto tempo. Ci sono altri metodi che potrebbero funzionare meglio, ma non sono stati testati su batteri che sono difficili da trattare.
Prime Editing: Un Nuovo Metodo
Recentemente è stato sviluppato un nuovo metodo chiamato prime editing. A differenza di CRISPR/Cas9, che taglia entrambi i filamenti del DNA, il prime editing usa un approccio diverso. Fa un solo taglio, il che aiuta a evitare alcuni degli errori che possono verificarsi quando il DNA si ripara da solo. Questo metodo ha mostrato promesse in altre forme di vita come piante e animali, ma i ricercatori vogliono vedere se può essere utile anche per i batteri.
Introdurre il Make-or-Break Prime Editing (mbPE)
In questo studio, è stato introdotto un nuovo metodo chiamato make-or-break prime editing (mbPE) per il batterio Streptococcus pneumoniae, che può causare infezioni negli esseri umani. Questo metodo combina la capacità di taglio del CRISPR con i vantaggi del prime editing per rendere i cambiamenti genetici più efficienti. Con l'mbPE, gli scienziati mirano a fare rapidamente e con precisione le modifiche ai geni batterici.
Come Funziona mbPE
L'mbPE usa un enzima speciale che può tagliare il DNA ed è attaccato a un altro pezzo che aiuta a inserire nuove informazioni genetiche. In questo modo, quando il DNA è tagliato, i batteri possono prendere le nuove informazioni e usarle per modificarsi. La parte interessante è che questo metodo permette ai ricercatori di selezionare quali batteri sono stati modificati con successo. I batteri che vengono cambiati correttamente sopravvivono mentre gli altri muoiono perché non possono riparare il taglio nel loro DNA.
Efficacia dell'mbPE nei Batteri
I ricercatori hanno testato il metodo mbPE su S. Pneumoniae. Sono riusciti a fare piccole modifiche (mutazioni puntiformi) e aggiungere o eliminare pezzi di DNA in modo efficiente. Hanno scoperto che, utilizzando gli strumenti giusti, circa il 93% dei batteri modificati ha avuto i cambiamenti desiderati.
Progettare gli Strumenti Giusti
Affinché l'mbPE funzioni bene, i ricercatori dovevano progettare strumenti specifici chiamati PegRNA. I pegRNA guidano il processo di editing e aiutano a mirare ai punti giusti nel DNA. La lunghezza e la struttura di questi pegRNA sono essenziali per il successo della modifica. I ricercatori hanno scoperto le migliori lunghezze per i pegRNA, il che ha migliorato l'efficienza dell'editing.
Testare Modifiche Multiple
Una possibilità interessante con l'mbPE è che può aiutare gli scienziati a fare diverse modifiche al DNA batterico allo stesso tempo. I ricercatori volevano vedere se il loro metodo potesse introdurre diversi tipi di cambiamenti, come mutazioni puntuali, inserimenti e deletions, tutto in un colpo solo. Hanno scoperto che utilizzando il loro metodo, potevano effettivamente fare queste modifiche multiple in modo efficace.
Applicazioni nel Mondo Reale
Con il metodo mbPE così efficiente, gli scienziati vedono molte potenziali applicazioni. Ad esempio, potrebbero usarlo per studiare le funzioni di diversi geni nei batteri, esaminare come i batteri rispondono agli antibiotici, o persino creare ceppi batterici che producono composti utili.
Strumenti per l'Ingegneria Genetica
Strumenti di ingegneria genetica come l'mbPE possono cambiare il nostro modo di lavorare con i batteri. La capacità di fare modifiche precise può aiutare i ricercatori a creare batteri che sono più utili per compiti come smaltire inquinanti, produrre biocarburanti o creare vaccini.
Esplorare le Interazioni Genetiche
Un'altra applicazione potrebbe includere lo studio di come diversi batteri interagiscono tra loro o con le cellule umane. Ad esempio, i ricercatori potrebbero contrassegnare alcuni geni con marcatori che aiutano a tracciare dove vanno e cosa fanno all'interno delle cellule batteriche. Questo può rivelare informazioni importanti su come funzionano i batteri e come possono essere controllati.
Prospettive Future con l'mbPE
La flessibilità e l'efficienza dell'mbPE suggeriscono che potrebbe essere applicato non solo a S. pneumoniae ma anche ad altri tipi di batteri. I ricercatori puntano ad espandere questo metodo a batteri che sono più difficili da trattare o a quelli che hanno ruoli importanti nella salute umana e nelle malattie.
Conclusione
In sintesi, lo sviluppo di make-or-break prime editing (mbPE) apre possibilità entusiasmanti per l'ingegneria genetica nei batteri. Rendendo il processo più veloce ed efficiente, i ricercatori sperano di ottenere una comprensione più profonda delle funzioni batteriche e, in definitiva, di usare queste intuizioni per applicazioni benefiche in medicina, biotecnologia e scienze ambientali.
Mentre gli scienziati continuano a perfezionare e migliorare l'mbPE e strumenti correlati, il potenziale per innovazioni nel campo della genetica batterica e delle sue applicazioni crescerà sempre di più.
Fonte originale
Titolo: Make-or-break prime editing for bacterial genome engineering
Estratto: CRISPR-Cas9 has revolutionized genome engineering by allowing precise introductions of DNA double-strand breaks (DSBs). However, genome engineering in bacteria is still a complex, multi-step process requiring a donor DNA template for repair of DSBs. Prime editing circumvents this need as the repair template is indirectly provided within the prime editing guide RNA (pegRNA). Here, we developed make-or-break Prime Editing (mbPE) that allows for precise and effective genetic engineering in the opportunistic human pathogen Streptococcus pneumoniae. In contrast to traditional prime editing in which a nicking Cas9 is employed, mbPE harnesses wild type Cas9 in combination with a pegRNA that destroys the seed region or protospacer adjacent motif. Since most bacteria poorly perform template-independent end joining, correctly genome-edited clones are selectively enriched during mbPE. We show that mbPE is RecA-independent and can be used to introduce point mutations, deletions and targeted insertions, including protein tags such as a split luciferase, at selection efficiencies of over 93%. mbPE enables sequential genome editing, is scalable, and can be used to generate pools of mutants in a high-throughput manner. The mbPE system and pegRNA design guidelines described here will ameliorate future bacterial genome editing endeavors.
Autori: Jan-Willem Veening, M. Rengifo-Gonzalez, M.-V. Mazzuoli, A. B. Janssen, A.-S. Rueff, X. Liu
Ultimo aggiornamento: 2024-12-13 00:00:00
Lingua: English
URL di origine: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.06.27.601116
Fonte PDF: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.06.27.601116.full.pdf
Licenza: https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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