Amélioration des techniques d'imagerie avec des brins d'ADN doublement marqués

Les brins d'ADN marqués avec des fluorophores sont des outils importants utilisés dans les techniques de microscopie avancées. Ces petits brins aident les scientifiques à mieux voir des choses très petites, comme les structures dans les cellules. Lorsqu'ils sont combinés avec des méthodes d'imagerie spéciales, ils permettent d'obtenir de meilleures images d'échantillons biologiques.

#Techniques Clés

Parmi les techniques de microscopie avancées qui utilisent ces brins d'ADN, on trouve :

• Microscopie de Localisation de Molécule Unique (SMLM) : Cette méthode aide à identifier la position des molécules individuelles dans un échantillon.
• Accumulation de Points d'ADN dans la Topographie Nanoscale (DNA-PAINT) : Cette technique utilise de courts brins d'ADN pour créer des images détaillées de structures.
• Imagerie de Fluctuation Optique Super-Résolution (SOFI) : Cette méthode fournit des images haute résolution en analysant les fluctuations de la lumière.
• Microscopie par Émission Stimulée de Déplétion (STED) : Cette technique offre des images super-résolues en utilisant un motif lumineux spécial pour éteindre les signaux de fond.

Un des grands avantages de l'utilisation de ces brins d'ADN est leur capacité à marquer plusieurs cibles en même temps. En lavant puis en réajoutant différents brins marqués, les scientifiques peuvent prendre des images répétées qui aident à construire une image plus complète de l'échantillon.

#Optimiser l'Imagerie avec des Étiquettes ADN

Un avantage spécifique de DNA-PAINT est qu'il permet aux scientifiques de mesurer la quantité d'une molécule spécifique présente. Cela peut être fait via un processus appelé analyse cinétique. Cependant, utiliser des étiquettes ADN à affinité faible peut poser des problèmes. Ces étiquettes doivent rester dans le tampon d'imagerie pendant les expériences, ce qui peut augmenter le bruit de fond et ralentir l'acquisition d'images.

Pour résoudre ce problème, les scientifiques ont introduit des fluorophores quenchés par FRET. Ce sont des types spéciaux de fluorophores qui, lorsqu'ils sont liés à des brins d'ADN plus longs, peuvent réduire le bruit de fond. Récemment, les scientifiques ont montré que l'utilisation de brins d'ADN aux deux extrémités avec des fluorophores identiques peut entraîner un auto-quenching. Cela signifie que lorsque les brins ne sont pas liés à leur cible, ils montrent une fluorescence plus faible, ce qui donne des images plus claires.

#Caractériser de Nouveaux Probes

Les scientifiques ont conçu plusieurs nouveaux brins d'ADN marqués avec des fluorophores, appelés "brins imageurs". Ils ont utilisé une séquence d'ADN commune et attaché des fluorophores aux extrémités ou à une seule extrémité. Les fluorophores choisis pour cette étude étaient Cy3B, rhodamine-silicium (SiR) et tétraméthylrhodamine (TMR).

Ils ont caractérisé ces brins en examinant leur comportement en solution lorsqu'ils sont seuls et lorsqu'ils se lient à un brin complémentaire. En regardant leurs propriétés d'absorption et de fluorescence, ils ont pu voir à quel point ces nouveaux brins étaient efficaces.

#Observations

Lorsque les brins imageurs portent deux fluorophores, leurs signaux fluorescents changent lorsqu'ils sont libres en solution par rapport à quand ils sont liés à une cible. En gros, le signal de fluorescence augmente considérablement lorsqu'ils se lient, indiquant que les brins doublement marqués sont efficaces pour l'imagerie.

Ils ont aussi observé des changements dans la vitesse à laquelle les brins se lient et se délient de leurs cibles, ce qui aide à déterminer combien de temps ils restent attachés pendant l'imagerie.

#Utilisation en Microscopie STED

Les nouveaux brins imageurs doublement marqués ont été testés en microscopie STED, où on espérait qu'ils réduiraient la fluorescence de fond observée avec des sondes non liées. Les résultats précédents montraient que certaines combinaisons de brins doublement marqués réduisaient efficacement le bruit de fond tout en augmentant la luminosité des sondes liées.

Les images obtenues ont montré que, tandis que certains brins avaient une diminution de l'intensité de fluorescence lorsqu'ils étaient liés, tous les brins doublement marqués affichaient des signaux de fond plus faibles comparativement à leurs homologues à marquage unique. Cela a conduit à un meilleur rapport signal-sur-bruit pour chaque brin doublement marqué utilisé en imagerie.

En plus, l'augmentation du rapport signal-sur-bruit était accompagnée d'une amélioration de la résolution des images. Cette amélioration signifie que les scientifiques pouvaient distinguer des détails plus petits dans leurs échantillons.

#Imagerie à Deux Couleurs

L'utilisation de brins doublement marqués a également permis aux scientifiques de réaliser une imagerie simultanée à deux couleurs. Cela signifie qu'ils pouvaient visualiser deux structures différentes dans une seule expérience, ce qui fournit des informations encore plus riches sur la biologie étudiée.

#Avancer la Microscopie DNA-PAINT

Les scientifiques ont aussi appliqué ces brins imageurs doublement marqués à la microscopie DNA-PAINT. Ils se sont concentrés sur Cy3B et SiR, connus pour leur stabilité et leur séparation spectrale. En comparant les performances des brins marqués simplement et doublement dans des structures d'ADN origami, ils ont pu évaluer comment ces brins performaient ensemble.

Les résultats ont montré que les brins doublement marqués offraient de meilleures propriétés de fluorescence, conduisant à de meilleurs résultats d'imagerie. L'augmentation du rendement en photons était significative, et les brins doublement marqués ont fourni une résolution améliorée.

#Visualiser des Structures Biologiques

En utilisant les brins imageurs doublement marqués, les scientifiques ont visualisé des structures importantes comme la protéine du complexe des pores nucléaires Nup96. Ils ont comparé la sortie de photons des brins marqués simplement et doublement, confirmant que les brins doublement marqués délivraient plus de photons et fournissaient de meilleurs détails d'image.

#Conclusion

Cette recherche met en lumière comment les dimères auto-quenchés attachés à de courts brins d'ADN peuvent améliorer de manière significative l'imagerie dans des techniques de microscopie avancées. En utilisant des sondes ADN doublement marquées, les scientifiques peuvent obtenir des rapports signal-sur-bruit plus élevés et une meilleure résolution d'image.

Les implications de ce travail vont au-delà d'un seul domaine de la microscopie. Les principes régissant ces brins doublement marqués pourraient être adaptés à d'autres techniques, menant à de nouvelles avancées dans l'imagerie biologique. Au final, cette recherche ouvre la voie à des observations plus précises des processus et structures biologiques au niveau moléculaire.