Ciblage de 3Cpro : Un chemin vers des traitements efficaces contre l'EV-D68

Développer des médicaments antiviraux abordables et accessibles dans le monde entier est super important pour se préparer aux futures pandémies. Même si les vaccins pour le SARS-CoV-2 ont été créés et distribués rapidement, plus de 6,9 millions de personnes sont mortes à cause du virus. Le nombre de décès aurait pu être bien plus bas s'il y avait eu des traitements antiviraux efficaces.

L'entérovirus D68 (EV-D68) est un virus qui touche surtout les enfants, provoquant des maladies respiratoires qui peuvent aller de légères à sévères et, dans certains cas, mener à des problèmes neurologiques graves appelés myélite flasque aiguë. Ce virus se propage via des gouttelettes respiratoires et des matières fécales, ce qui soulève des inquiétudes quant aux épidémies possibles. Depuis 2014, il y a eu de grosses épidémies à l'échelle mondiale, y compris une aux États-Unis qui a touché plus d'un millier de patients. Malgré la recherche en cours sur des antiviraux ciblant l'EV-D68, il n'y a actuellement ni vaccins ni traitements pour cette infection.

#EV-D68 et sa protéase

Dans le cycle de vie de l'EV-D68, le matériel génétique du virus est transformé en un polyprotéine, qui est ensuite clivée par des protéases appelées 2A, 3C et 3CD. La protéase 3C (3Cpro) est un type spécifique de protéase qui joue des rôles importants dans le traitement de la polyprotéine. Cette enzyme a une structure similaire à celle d'une autre famille de protéases et est cruciale pour la réplication du virus.

L'enzyme 3Cpro se compose de deux parties et présente un ensemble spécifique d'acides aminés qui composent son site actif. Ce site actif permet à 3Cpro d'interagir avec des protéines virales et humaines, aidant à la réplication du virus tout en entravant la réponse immunitaire du corps.

Des recherches ont montré que les séquences de substrat de 3Cpro contiennent plusieurs acides aminés conservés qui sont cruciaux pour son action. Cette conservation suggère qu'il pourrait être possible de créer des traitements efficaces contre de nombreux types de picornavirus, y compris l'EV-D68.

#Découverte de médicaments basée sur des fragments

Pour trouver de nouveaux médicaments antiviraux, les scientifiques utilisent une méthode appelée découverte de médicaments basée sur des fragments (FBDD). Cette technique consiste à tester de petites bibliothèques de composés simples, plutôt que de grandes collections de composés complexes. En testant des molécules plus simples, les chercheurs peuvent identifier des candidats prometteurs qui peuvent ensuite être modifiés pour devenir des médicaments plus complexes.

Une méthode sensible pour utiliser la FBDD est le criblage de fragments cristallographiques, qui permet aux scientifiques d'observer directement où et comment ces fragments se lient aux protéines. Cette info est essentielle pour concevoir des nouveaux composés antiviraux de manière optimale. Les chercheurs peuvent rapidement affiner et améliorer ces candidats à travers plusieurs cycles de conception et de test.

Ici, on parle d'un criblage de fragments cristallographiques réalisé sur 3Cpro. Au total, 1 231 fragments ont été analysés, ce qui a conduit à l'identification de 101 composés qui se sont liés avec succès à l'enzyme.

#Méthodes

#Conception du gène de 3Cpro

Un gène codant pour l'enzyme 3Cpro de l'EV-D68 a été créé et cloné dans un vecteur spécifique. Ce gène permet de produire la protéase en laboratoire.

#Expression et purification de 3Cpro

Pour produire 3Cpro, le gène cloné a été introduit dans des bactéries, qui ont ensuite été cultivées dans des conditions spécifiques. Après induction, les bactéries ont été récoltées, et plusieurs étapes de purification ont été réalisées pour isoler l'enzyme 3Cpro.

#Test FRET pour l'activité de 3Cpro

Une fois purifié, l'activité de 3Cpro a été mesurée à l'aide d'un test spécifique qui quantifie sa capacité à cliver un substrat. Les résultats ont montré que le 3Cpro construit était actif et prêt pour d'autres études.

#Cristallisation de 3Cpro

Le 3Cpro purifié a été soumis à des expériences de cristallisation, utilisant différentes conditions pour faire pousser des cristaux de l'enzyme. Après avoir optimisé le processus de cristallisation, des cristaux ont été obtenus avec succès et congelés pour analyse.

#Criblage de fragments cristallographiques

Les criblages ont impliqué de plonger les cristaux obtenus dans des fragments de diverses bibliothèques pour observer quels fragments se lieraient efficacement. Après immersion, des données de diffraction des rayons X ont été collectées pour comprendre comment les fragments interagissaient avec le 3Cpro.

#Résultats

#Mesure de l'activité de 3Cpro

Le test FRET a confirmé l'activité de 3Cpro, montrant une forte réaction face à un inhibiteur connu, GC376. Cela a indiqué que l'enzyme conçue était fonctionnelle pour d'autres études.

#Structure de 3Cpro

La structure cristalline de 3Cpro a été déterminée, révélant l'agencement de ses deux monomères. La structure a mis en évidence les caractéristiques typiques des sérine protéases, avec un site actif composé de cinq sous-unités.

#Sites de liaison identifiés

Lors du criblage de fragments, plusieurs sites de liaison ont été observés :

1. Site actif du monomère A : Des fragments se sont liés dans le site actif du monomère A, où ils imitaient des parties des substrats naturels que 3Cpro traite.

2. Interface monomère-mononère : Un autre ensemble de fragments s'est lié à l'interface entre les deux monomères, bien que ceux-ci soient moins susceptibles d'être viables pour le développement de médicaments à cause de la nature artificielle de la liaison.

3. Analyse de poche : Une poche autour de résidus spécifiques dans le monomère B a également été identifiée, retenant de nombreux fragments, mais n'ayant pas été observée dans le monomère A.

#Élaboration des fragments

Après avoir identifié les fragments qui se sont bien liés, l'étape suivante était de concevoir de nouveaux composés basés sur ces premiers succès. Différentes méthodes computationnelles ont été utilisées pour créer un ensemble diversifié de nouveaux composés à tester.

#Comparaison structurale et diversité

L'accent était mis sur la création de composés qui maintenaient les interactions avec les résidus critiques identifiés dans les sites de liaison. Les composés ont été soigneusement analysés pour leur potentiel à améliorer les interactions tout en s'assurant qu'ils ne s'éloignaient pas trop des fragments d'origine.

#Directions futures

Les résultats soulignent la nécessité de continuer les efforts pour développer des composés antiviraux ciblant 3Cpro et des enzymes similaires. Les travaux futurs devraient se concentrer sur l'optimisation de ces pistes pour améliorer la liaison et garantir qu'ils peuvent efficacement inhiber la fonction du virus.

#Conclusion

Le développement rapide de composés antiviraux est essentiel pour se préparer aux pandémies. Le criblage de fragments cristallographiques a révélé de nombreux candidats médicaments potentiels contre l'enzyme 3Cpro de l'EV-D68. La recherche et l'innovation continues dans la conception de médicaments pourraient mener à des thérapies salvatrices dont on a grand besoin lors des futures crises sanitaires. Les méthodologies utilisées peuvent servir de modèle pour traiter d'autres menaces virales également.