Fragmentation de l'ADN pour une meilleure séquençage

Quand on bosse avec de l'ADN génomique pour le Séquençage, c'est souvent utile de casser l'ADN en morceaux plus petits. Ce processus s'appelle la Fragmentation. En découpant l'ADN en morceaux plus petits, ça peut donner de meilleurs résultats avec certaines machines de séquençage, comme celles d'Oxford Nanopore Technologies (ONT). Des morceaux plus petits rendent plus facile de mesurer la concentration d'ADN et peuvent augmenter la quantité totale d'ADN séquencé. Mais, même si la fragmentation a ses avantages, ça peut aussi réduire la longueur moyenne des fragments d'ADN.

#Pourquoi Fragmenter l'ADN ?

Casser l'ADN en morceaux plus courts peut aider de plusieurs façons. D'abord, ça rend l'échantillon plus uniforme, ce qui veut dire que les tailles des fragments sont mieux réparties. Cette uniformité permet de mieux estimer la quantité d'ADN dans l'échantillon. En plus, des fragments plus courts sont moins susceptibles de se perdre pendant le processus de préparation. Les fragments plus longs peuvent être plus compliqués à manipuler, et ils risquent de se perdre pendant les étapes de nettoyage. De plus, séquencer des fragments plus courts mène souvent à un meilleur rendement, ce qui veut dire plus de données exploitables du processus de séquençage.

Mais, il faut aussi reconnaître que la fragmentation a ses inconvénients. Un des principaux inconvénients, c'est que ça réduit le N50 de la bibliothèque. Le N50 est une mesure qui indique la longueur des fragments d'ADN, et avoir des longueurs plus longues est généralement souhaitable en séquençage.

#Méthodes de Fragmentation

Il y a plusieurs façons de casser l'ADN en morceaux plus petits avant le séquençage, et une des méthodes les plus rapides est d'utiliser un appareil appelé Covaris g-TUBEs. Dans cette méthode, l'échantillon d'ADN est poussé à travers une petite ouverture grâce à une centrifugeuse. La force appliquée peut être ajustée, ce qui donne des tailles de fragments d'ADN différentes. Les principaux facteurs qui influencent comment l'ADN est cassé incluent :

1. Volume de l'échantillon
2. Concentration d'ADN
3. La force appliquée pendant le processus de centrifugation

Selon les notes du fabricant, quand on fragmente l'ADN à des tailles en dessous de 8 kilobases (kb), le temps requis peut être réduit. Toutefois, pour nos besoins, on a décidé de garder le temps à une minute pour obtenir les fragments plus longs qu'on visait.

#Comprendre la Préparation de l'Échantillon

En général, l'ADN fourni pour la préparation va de 1 à 2 microgrammes (µg). Pendant la préparation, on a utilisé un plus petit volume (50 µL) pour éviter d'avoir à ajuster la concentration d'ADN plus tard. On a remarqué que ce plus petit volume avait des effets notables sur le processus de fragmentation. Par exemple, en utilisant 1500 RCF (force centrifuge relative) avec 50 µL d'un échantillon de 0,5 µg, on a obtenu une taille de fragment moyenne d'environ 14,051 paires de bases (pb), tandis qu'un échantillon de 1 µg produisait des fragments d'une moyenne de 15,651 pb. Les deux tailles sont plus courtes que l'objectif de 20 kb qu'on visait.

Pour trouver la meilleure façon d'atteindre notre objectif, on a testé différentes quantités d'ADN et différentes forces centrifuges. Nos principaux objectifs étaient :

1. Identifier la RCF appropriée pour obtenir des fragments d'ADN autour de 20 kb à partir d'échantillons allant de 0,5 à 4 µg.
2. Déterminer la meilleure méthode pour mesurer la taille des fragments.

Lors de nos tests, on a constaté que même si les g-TUBEs de Covaris sont indiqués comme étant à usage unique, on pouvait les réutiliser quelques fois avant que les membranes ne soient obstruées.

#L'Expérience

On a préparé trois types d'échantillons pour chaque quantité d'ADN : 0,5, 1, 2 et 4 µg. Chaque échantillon a été testé à trois forces centrifuges différentes : 1000, 1500 et 2000 RCF. On a gardé le temps de traitement à une minute pour tous les échantillons.

Pour analyser la taille des fragments d'ADN, on a utilisé deux appareils : le Femto Pulse System et le Fragment Analyzer. Le Femto Pulse est connu pour sa capacité à mesurer des fragments plus grands, tandis que le Fragment Analyzer fournit aussi des données précieuses mais peut avoir des limitations sur la précision des tailles.

#Résultats

On a réussi à préparer des échantillons avec les g-Tubes, et la fragmentation était clairement visible dans les résultats. Avant la fragmentation, l'ADN montrait un large pic dans les mesures, indiquant de longs fragments. Après avoir utilisé les g-Tubes, on a observé un pic unique et étroit, suggérant que l'ADN avait été efficacement cassé en morceaux plus petits.

Les résultats ont montré qu'en augmentant la quantité d'ADN, la taille moyenne des fragments augmentait avec des forces centrifuges plus faibles. Par exemple, à 1000 et 1500 RCF, les tailles moyennes des fragments étaient nettement plus grandes quand on utilisait plus d'ADN. Cependant, à 2000 RCF, les différences de tailles de fragments devenaient moins significatives, peu importe la concentration d'ADN.

On a aussi remarqué qu'augmenter la force centrifuge avait tendance à réduire la taille moyenne des fragments. Cet effet était plus visible quand la quantité d'ADN était plus élevée.

#Comparaison entre Systèmes de Mesure

On a comparé les résultats du Femto Pulse et du Fragment Analyzer. Les deux systèmes ont généralement fourni des résultats de taille moyenne similaires, mais il y avait quelques différences. Le Femto Pulse avait tendance à montrer des tailles de fragments plus petites par rapport au Fragment Analyzer. Cependant, les plus gros fragments semblaient plus grands quand mesurés avec le Fragment Analyzer.

Dans les cas où la mesure précise est cruciale, on recommande de faire plusieurs échantillons ou de répéter les tests pour garantir la précision, surtout en utilisant le Fragment Analyzer, qui parfois montrait des artefacts rendant les mesures compliquées. Pour obtenir les meilleurs résultats, il est préférable de faire des réglages de course prolongés sur le système Femto Pulse.

#Conclusions

D'après nos observations, il semble que les g-TUBEs de Covaris peuvent efficacement fragmenter l'ADN, et la taille des fragments peut être contrôlée en ajustant la force centrifuge et la quantité d'ADN utilisée. Pour obtenir des fragments d'ADN autour de 20 kb, on a trouvé qu'utiliser 1000 RCF était efficace pour des échantillons de 1 µg ou moins, tandis que 1500 RCF était adéquat pour des échantillons de 2 µg. Pour des échantillons de 4 µg, une force entre 1500 et 2000 RCF était nécessaire pour obtenir des fragments dans la plage désirée.

Dans l'ensemble, notre étude montre que la fragmentation de l'ADN peut être un processus simple qui aide à préparer des échantillons pour le séquençage, et dans les bonnes conditions, ça peut donner des résultats utiles et fiables.