Avancées dans l'assemblage génétique modulaire : MultiGreen

La technologie d'expression génique joue un rôle crucial dans la recherche scientifique et les applications commerciales. Au début, des méthodes simples pour créer des unités d'expression génique étaient suffisantes. Ces unités se composent de parties essentielles, y compris un promoteur, une séquence codante et un terminateur. Ces méthodes s'appuyaient largement sur des techniques de clonage traditionnelles où des morceaux d'ADN étaient manuellement coupés et assemblés. Cependant, à mesure que la demande pour des modifications génétiques plus complexes augmentait, des méthodes plus efficaces étaient nécessaires.

#Techniques de clonage traditionnelles

Le clonage traditionnel implique l'utilisation d'un backbone, qui sert de structure de support, et divers outils appelés enzymes de restriction pour couper et joindre des segments d'ADN. Chaque unité construite a généralement quatre composants de base :

• Promoteur et 5' UTR : C'est la partie qui initie l'expression génique.
• Séquence codante : C'est ce qui contient les instructions réelles pour fabriquer une protéine.
• Terminateur et 3' UTR : Cela signale la fin de l'expression génique.
• Backbone de vecteur : Cela fournit le cadre pour tout maintenir ensemble.

Bien que les méthodes traditionnelles soient utiles, elles ont des limites, surtout quand plusieurs gènes doivent être assemblés en même temps. À mesure que les projets devenaient plus compliqués, nécessitant plus de gènes à éditer ou empiler, le besoin de meilleures techniques de clonage est apparu.

#Techniques d'assemblage modulaires

Pour faire face à la complexité croissante, les scientifiques ont commencé à développer des techniques d'assemblage modulaires. Une des premières approches s'appelait le clonage Gateway. Cette méthode utilise des enzymes spéciales qui peuvent combiner précisément des segments d'ADN. Elle permet l'assemblage de plusieurs morceaux d'ADN dans un ordre spécifique à l'aide d'une série de réactions.

Malgré ses avantages, le clonage Gateway peut laisser derrière lui des morceaux d'ADN indésirables, appelés cicatrices, qui peuvent compliquer le produit final.

#Avancées dans le clonage : Clonage Golden Gate

Le clonage Golden Gate a émergé comme une méthode plus efficace pour l'assemblage modulaire, permettant une construction rapide des séquences d'ADN en une seule étape. Il utilise un type spécial d'enzyme qui effectue des coupures en dehors de leurs séquences de reconnaissance, laissant derrière de petits morceaux d'ADN appelés surplombs. Cette méthode peut combiner plusieurs fragments d'ADN en une seule réaction, rendant beaucoup plus rapide et plus facile pour les scientifiques de créer des constructions génétiques complexes.

Plusieurs systèmes basés sur le clonage Golden Gate ont été développés, chacun avec des caractéristiques uniques. Tous visent à rationaliser les processus en organisant les composants pour un assemblage plus facile. Les facteurs clés qui déterminent le fonctionnement de chaque système incluent le choix des enzymes, la structure des surplombs, et comment les composants sont organisés pendant l'assemblage.

#Deux principales tâches des systèmes d'assemblage modulaire

Les systèmes modernes d'assemblage modulaire doivent atteindre deux objectifs principaux :

1. Assembler les composants de base, comme les promoteurs et les séquences codantes, en unités fonctionnelles.
2. Combiner ces unités fonctionnelles en un vecteur multi-gènes capable de fonctionner comme prévu.

Pour accomplir ces tâches, la plupart des systèmes s'appuient sur plusieurs étapes d'assemblage, permettant flexibilité et précision.

#Étapes d'assemblage de niveau 0 et de niveau 1

La première étape de la création d'une unité d'expression génique consiste à produire des vecteurs "de base" ou "d'entrée". Ceux-ci contiennent un composant pour l'expression génique, chacun équipé de séquences spécialisées pour faciliter l'assemblage. Après avoir créé ces vecteurs d'entrée, un second tour d'assemblage est effectué pour produire des unités transcriptionnelles individuelles, représentant les constructions géniques fonctionnelles.

Ces unités individuelles peuvent ensuite être combinées en un assemblage final, souvent appelé un assemblage de "niveau 2". Il est également possible de combiner les unités de manière itérative avant de créer le produit final, permettant une plus grande complexité dans la conception.

#Systèmes modulaires polyvalents

Différents systèmes ont émergé pour aider à rationaliser le processus d'assemblage. Alors que certains systèmes s'appuient sur un type d'enzyme, d'autres utilisent plusieurs enzymes pour améliorer l'efficacité. Un système d'assemblage modulaire efficace peut faire gagner du temps et des ressources en permettant aux scientifiques d'ajuster rapidement et d'échanger des composants sans repartir de zéro.

Parmi ces systèmes, GreenGate se distingue par sa facilité d'utilisation et sa flexibilité. Il permet aux chercheurs de contrôler toutes les pièces cruciales nécessaires à l'expression des plantes, ce qui en fait un choix populaire en biotechnologie végétale.

#Présentation de MultiGreen : une nouvelle solution

Pour améliorer les méthodes d'assemblage existantes, le système MultiGreen a été proposé. Ce système repose sur les bases du kit original GreenGate mais offre plus de polyvalence pour assembler plusieurs composants à la fois. MultiGreen se compose de deux approches principales :

1. MultiGreen 1.0 : Se concentre sur l'assemblage en série, permettant l'empilement étape par étape des unités génétiques.
2. MultiGreen 2.0 : Permet l'assemblage en parallèle, ce qui améliore considérablement l'efficacité et la rapidité.

MultiGreen permet l'intégration de diverses unités transcriptionnelles en un seul plasmide tout en maintenant l'organisation et la clarté du processus d'assemblage.

#MultiGreen 1.0 : Assemblage en série

MultiGreen 1.0 s'appuie sur la méthode GreenGate en introduisant un composant supplémentaire, connu sous le nom de surplomb H, qui permet des assemblages plus complexes. Cette version est particulièrement utile lorsque de nombreuses unités transcriptionnelles doivent être empilées ensemble dans un ordre spécifique.

Le processus utilise une série de marqueurs visuels qui aident les chercheurs à identifier facilement quels composants ont été correctement assemblés à chaque étape. Cela rend le dépistage des assemblages réussis beaucoup plus simple et réduit les risques d'erreurs.

#MultiGreen 2.0 : Assemblage en parallèle

En revanche, MultiGreen 2.0 porte l'efficacité à un autre niveau en permettant plusieurs assemblages de se produire simultanément. Avec cette méthode, jusqu'à six unités différentes peuvent être combinées en une seule réaction, accélérant considérablement le processus de création de constructions génétiques complexes.

Cette version utilise également des stratégies uniques pour alterner les types de résistance aux antibiotiques utilisés, aidant à prévenir le passage de matériel plasmidique indésirable d'une étape à une autre. L'objectif est de faciliter l'adaptation, le changement ou la réutilisation des composants selon les besoins.

#Applications pratiques de MultiGreen

Les deux versions de MultiGreen ont été validées à travers une série d'expériences, prouvant leur efficacité à produire des constructions géniques fonctionnelles. Par exemple, le processus a été utilisé pour reconstruire des voies de production de composés spécifiques, comme des pigments, dans des bactéries.

De plus, le système MultiGreen a montré des promesses dans la création de constructions pour une utilisation dans des plantes, permettant aux scientifiques de développer de nouveaux traits ou caractéristiques plus efficacement que les méthodes précédentes.

#Tests et résultats

Les premiers tests effectués avec MultiGreen se concentraient sur la production d'un composé appelé protoviolaceinate, en utilisant des bactéries comme organisme modèle. Plusieurs assemblages ont été tentés, et les conditions ajustées pour optimiser le résultat.

Les résultats ont démontré que MultiGreen pouvait atteindre des taux d'efficacité élevés dans la production de constructions fonctionnelles tout en rendant plus simple le dépistage des assemblages réussis.

De même, le système MultiGreen a été appliqué à un modèle de plante, confirmant sa capacité à faciliter la production de produits souhaités dans un système eucaryote.

#Conclusion

MultiGreen représente une avancée passionnante par rapport aux méthodes de clonage traditionnelles, offrant un moyen plus efficace et flexible de créer des constructions génétiques complexes. En permettant à la fois des méthodes d'assemblage en série et en parallèle, il permet aux chercheurs de travailler plus efficacement et d'innover plus rapidement.

À mesure que le besoin d'ingénierie génétique sophistiquée augmente, des outils comme MultiGreen deviendront de plus en plus importants, ouvrant la voie à de nouvelles découvertes dans l'amélioration agricole, la médecine, et au-delà.