Nuevas ideas sobre los mecanismos de las bacterias de la TB

La tuberculosis, o TB, es una enfermedad infecciosa causada por una bacteria llamada Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Esta enfermedad es un problema serio en todo el mundo, matando a más de 1.6 millones de personas cada año. Uno de los desafíos con la TB es que la bacteria puede esconderse del sistema inmunológico y puede permanecer inactiva en una persona durante muchos años. Se cree que alrededor de 1.7 mil millones de personas en todo el mundo tienen una infección latente de Mtb. Además, el problema se agrava por el aumento de casos donde las bacterias son resistentes a los medicamentos.

#Cómo Mtb Infecta el Cuerpo

Para establecer una infección en una persona, Mtb usa varias herramientas, conocidas como factores de virulencia, que se entregan a través de sistemas especiales dentro de la bacteria. Investigaciones han mostrado que Mtb puede dañar ciertas estructuras celulares, específicamente la membrana fagosómica. Este proceso se basa principalmente en uno de sus sistemas de secreción llamado ESX-1. El principal responsable de la actividad dañina es una proteína llamada ESAT-6. La comprensión de cómo funciona ESAT-6 aún está en progreso.

Los investigadores han realizado muchos estudios para entender cómo ESAT-6 causa daño a la membrana y cómo esto podría permitir a Mtb escapar de su área de contención dentro de las células. Sin embargo, estudios anteriores han tenido problemas, como contaminación con detergente, lo que complica los hallazgos. Recientemente, los investigadores se han enfocado en estudiar bacterias enteras para evitar usar proteínas aisladas. Aunque estos experimentos han proporcionado información valiosa, se complican por cómo diferentes componentes del sistema de secreción trabajan juntos.

#Hallazgos Recientes sobre ESAT-6

A pesar de mucho trabajo, los científicos aún no han logrado aclarar cómo opera ESAT-6. Este estudio busca abordar eso mediante pruebas exhaustivas en diferentes condiciones. Se utilizan diversas técnicas, incluyendo un método llamado interferometría de biocapa (BLI) para medir cuán bien se une ESAT-6 a otra proteína llamada CFP-10. Los científicos también utilizan técnicas de imagen avanzadas para ver cómo ESAT-6 forma grandes grupos.

Los investigadores generaron un nuevo tipo de nanobodies de alpacas que pueden unirse a ESAT-6. Este nanobody sirve como herramienta para estudiar la función de ESAT-6 durante la infección por Mtb. Realizaron varias pruebas para entender cómo este nanobody funciona en la prevención del crecimiento de Mtb dentro de las células infectadas.

#Producción de Proteínas ESAT-6 y CFP-10

Para estudiar ESAT-6 y CFP-10, el equipo creó estas proteínas usando bacterias. Produjeron las proteínas en E. coli, un tipo común de bacteria que se usa en laboratorios. Revisaron la secuencia de ADN utilizada para crear las proteínas y confirmaron que tenían la secuencia correcta. Luego purificaron las proteínas, asegurándose de que fueran de buena calidad para más pruebas. Estas proteínas son esenciales para investigar cómo ESAT-6 interactúa con CFP-10.

#Validación de la Formación de Dimeros

Uno de los principales objetivos era ver si ESAT-6 y CFP-10 podían formar un emparejamiento estable, conocido como un dímero. Los investigadores probaron diferentes mezclas de estas proteínas para ver cómo se comportaban en diferentes condiciones. Usaron una técnica llamada native-PAGE para analizar las mezclas, lo que confirmó que ESAT-6 y CFP-10 pueden formar un complejo.

#Prueba de la Actividad Hemolítica

Otro aspecto importante de la investigación fue probar si ESAT-6 podía causar hemólisis, que es la ruptura de los glóbulos rojos. Estudios anteriores habían tenido resultados mixtos, pero los investigadores encontraron que su forma de ESAT-6 no causaba hemólisis por sí sola. Sin embargo, encontraron que ciertas bacterias podían interrumpir los glóbulos rojos cuando entraban en contacto directo con ellos. Esto planteó preguntas sobre cómo se comporta Mtb en comparación con su pariente cercano, Mycobacterium marinum (Mm).

#Medición de la Fuerza de Unión

Para entender la fuerza de las interacciones entre ESAT-6 y CFP-10, los investigadores realizaron experimentos usando BLI. Descubrieron que, aunque ESAT-6 interactúa fuertemente con CFP-10, también tiene la capacidad de asociarse consigo mismo. Esta autoasociación ocurre de manera más significativa en condiciones ácidas, lo que coincide con lo que se encuentra dentro de las células infectadas. Los hallazgos sugieren que las condiciones ácidas fomentan la formación de complejos más grandes de ESAT-6, lo que puede tener implicaciones para su función.

#Formación de Grandes Complejos de ESAT-6

Los investigadores notaron que a niveles de pH más bajos, ESAT-6 formó estructuras más grandes en comparación con condiciones neutras. Realizaron pruebas adicionales para ver cuánto tiempo tardaban en formarse estos complejos más grandes. Observaron que estos complejos se volvían más visibles cuando ESAT-6 estaba a un pH de 4.5, en comparación con cuando estaba a un pH de 7.5. Esto indicó que el entorno ácido dentro de ciertas células podría desencadenar cambios significativos en ESAT-6.

#Observación de Complejos de ESAT-6

Usando técnicas de imagen, los investigadores pudieron visualizar estos grandes complejos de ESAT-6. Mezclaron diferentes formas de ESAT-6 y las observaron bajo un microscopio. Las imágenes revelaron estructuras intrincadas que no estaban presentes en condiciones neutras. Esto sugiere que el entorno realmente influye en el comportamiento de ESAT-6.

#Análisis de Estequiometría

Para investigar más sobre la naturaleza de los complejos de ESAT-6, el equipo empleó un método que mide el peso molecular de los compuestos a medida que pasan por una columna. A pH neutro, encontraron que ESAT-6 formaba Dímeros, mientras que a pH ácido se notó la presencia de complejos más grandes. Esto proporcionó información sobre cómo ESAT-6 interactúa en diferentes condiciones.

#Desarrollo de un Nanobody Contra ESAT-6

El estudio también incluyó la generación de un nanobody que se dirige específicamente a ESAT-6. Esta nueva herramienta puede ayudar a los investigadores a observar cómo funciona ESAT-6 durante la infección. El estudio encontró que este nanobody podía unirse a ESAT-6 y proporcionar información útil sobre su papel en las infecciones por Mtb.

#Pruebas Funcionales con el Nanobody

Los investigadores realizaron pruebas para ver si el nuevo nanobody podía reducir el crecimiento de Mtb en las células. Usaron diferentes enfoques, incluyendo observar células infectadas con una cepa modificada de Mtb que brillaba en la oscuridad. Los resultados mostraron que las células tratadas con el nanobody tenían una reducción significativa en el crecimiento de bacterias en comparación con las tratadas con un control.

#Conclusiones

Este estudio destaca varios hallazgos importantes sobre ESAT-6. Primero, establece que ESAT-6 puede formar rápidamente grandes complejos en ambientes ácidos. Segundo, en ausencia de CFP-10, ESAT-6 permanece dimérico en condiciones neutras. Por último, el nanobody recién desarrollado, E11rv, muestra promesas en inhibir el crecimiento de Mtb dentro de las células.

Los investigadores notaron algunos hallazgos sorprendentes respecto a la información incompleta sobre la secuencia de aminoácidos de uno de los constructos de ESAT-6 más comúnmente utilizados. Sin embargo, sus datos no indicaron diferencias prácticas entre constructos con diferentes etiquetas.

En general, investigar la función de los factores de virulencia de Mtb presenta desafíos debido a la difícil naturaleza de tratar con la bacteria en un sistema vivo. Los hallazgos de esta investigación pueden proporcionar nuevos métodos para entender cómo Mtb interactúa con las células huésped, lo que podría llevar a nuevos enfoques para tratar y manejar infecciones de TB.