Avances en técnicas de cribado CRISPR

Las pantallas de CRISPR agrupadas son una forma rápida y económica de averiguar qué genes juegan un papel en funciones biológicas específicas. El procedimiento estándar implica producir lentivirus que llevan un ARN guía único (sgRNA) que apunta a un gen de interés. Después de que los virus se entregan a las células, cada célula se infecta con, como máximo, un virus, lo que lleva al knockout de un gen aleatorio. Luego se seleccionan las células según los cambios en sus características después del knockout del gen. Para identificar qué sgRNA fue responsable de estos cambios, los científicos extraen el material genético de las células, amplifican la secuencia de sgRNA y la analizan usando secuenciación de alto rendimiento.

#Lo básico de la amplificación de sgRNA de CRISPR

Una parte importante del proceso es la amplificación del sgRNA de CRISPR, que se puede hacer utilizando sondas de inversión molecular (MIPS). Esta técnica ofrece mejor especificidad y sensibilidad, permitiendo a los investigadores capturar y analizar el sgRNA de manera más efectiva.

#Desafíos en las pantallas de CRISPR agrupadas

Aunque las pantallas de CRISPR agrupadas son poderosas, realizarlas no está exento de desafíos. El éxito depende de varios aspectos técnicos, como qué tan bien los virus pueden infectar las células objetivo y cuán eficientemente pueden editar genes. Estos desafíos son especialmente notables al trabajar con células primarias. Además, tener un número limitado de sgRNAs para cuantificar puede dificultar el análisis estadístico.

Para abordar algunos de estos problemas, los científicos han desarrollado métodos computacionales mejorados y virus de seguimiento de linaje para rastrear mejor qué genes están siendo eliminados. Sin embargo, generar bibliotecas virales complejas ha demostrado ser una tarea desafiante, y pueden ocurrir errores durante los procesos de clonación y transfección.

#Enfoque en la amplificación PCR

Nuestra investigación examina una preocupación específica: el efecto de la amplificación PCR de los sgRNAs en la fiabilidad de los resultados estadísticos en las pantallas de CRISPR. La amplificación PCR típica puede no representar con precisión el número verdadero de células. Dado que el mismo sgRNA puede ser copiado varias veces durante la PCR, las lecturas resultantes se vuelven interdependientes, lo que complica el modelado estadístico.

Esta dependencia viola suposiciones estadísticas comunes, por lo que necesitamos encontrar una mejor manera de analizar los datos. Una técnica que utiliza identificadores moleculares únicos (UMIs) puede ayudar con esto, permitiendo a los investigadores distinguir las lecturas que provienen del mismo sgRNA. Sin embargo, agregar UMIs a los protocolos estándar de PCR no es tan sencillo.

#Introduciendo MIPs

En lugar del enfoque convencional de PCR, proponemos usar amplificación basada en MIP. Las MIPs permiten un targeting altamente específico y eficiente de ciertos fragmentos de ADN, reduciendo así el ruido de fondo en los datos finales. Las MIPs tienen varias aplicaciones, y ahora buscamos adaptarlas para pantallas de CRISPR. Nuestro nuevo método ha demostrado ser sencillo y puede reemplazar los protocolos de PCR existentes, facilitando obtener resultados más precisos.

#Optimización inicial del protocolo CRISPR-MIP

Para probar nuestro nuevo método, utilizamos un modelo de pantalla CRISPR de un sgRNA con células de cáncer de páncreas. A través de la optimización, establecimos que una cantidad específica de sondas por reacción funcionó mejor para el número dado de células. Nuestro protocolo final demostró alta especificidad, sin ruido de fondo de productos no deseados.

También investigamos si digerir el ADN genómico antes de la amplificación MIP podría mejorar los resultados, pero los beneficios fueron menores al comparar diferentes preparaciones de ADN.

#Comparando CRISPR-MIP con PCR tradicional

A continuación, queríamos evaluar qué tan bien funcionó nuestro método CRISPR-MIP en comparación con la PCR tradicional. Realizamos una pantalla de dropout utilizando una biblioteca que apunta a muchos genes de Quinasas humanas. Después de preparar bibliotecas de sgRNA utilizando ambas técnicas, implementamos un proceso de deduplicación personalizado para los datos de CRISPR-MIP.

Nuestro análisis reveló que CRISPR-MIP ofrece una salida estadística más robusta que la PCR, especialmente a medida que aumenta la profundidad de secuenciación. Mientras que la PCR mostró tendencias inesperadas en sgRNAs significativos, CRISPR-MIP mantuvo una relación constante entre la profundidad de secuenciación y la significancia. Esto indicó que la PCR podría inflar las estadísticas, llevando a resultados poco confiables.

#Identificando genes esenciales

También examinamos la efectividad de CRISPR-MIP en la identificación de genes esenciales en comparación con la PCR. En nuestras pruebas, CRISPR-MIP descubrió muchos más hits significativos que la PCR tradicional. A pesar de los pocos hits compartidos en los primeros lugares entre ambos métodos, CRISPR-MIP mostró mayor sensibilidad en general.

Encontramos diferencias notables en los rankings de genes específicos y su significancia, iluminando los tipos de genes que la PCR podría pasar por alto. Esto sugiere que, aunque los resultados principales pueden ser consistentes entre ambos métodos, CRISPR-MIP permite la detección de genes relevantes adicionales que podrían pasar desapercibidos con la PCR.

#Entendiendo la variabilidad en PCR

Al examinar las diferencias entre CRISPR-MIP y PCR, notamos que ambos métodos produjeron una abundancia similar de sgRNA para ciertos genes. Sin embargo, la PCR mostró una mayor variabilidad en la abundancia de sgRNA entre muestras. Esta variabilidad probablemente afectó la interpretación estadística general de los resultados.

Descubrimos que el contenido de GC de los sgRNAs tuvo un efecto significativo en la abundancia, lo que podría sesgar los resultados al analizar datos de PCR. Un bajo contenido de GC se asoció con mayores abundancias, indicando que la eficacia de la PCR podría verse influenciada por la temperatura de fusión del ADN.

#Implicaciones del sesgo de GC

Nuestros hallazgos destacan cómo el uso de PCR de plásmido como referencia puede llevar a resultados engañosos, especialmente respecto a la esencialidad de genes. Cuando exploramos conjuntos de datos grandes existentes, vimos evidencia del sesgo de contenido de GC que afecta la estimación de genes en varios estudios.

Esto plantea un punto importante sobre la necesidad de interpretaciones precisas de las pantallas de CRISPR, especialmente en estudios donde se utilizó PCR derivada de plásmido como referencia. Sugerimos que los investigadores tengan cuidado al sacar conclusiones de dichos datos y consideren los sesgos potenciales introducidos por los métodos de PCR.

#Recomendaciones para la implementación de CRISPR-MIP

En esta investigación, hemos abordado con éxito los problemas estadísticos asociados a la amplificación de sgRNA durante pantallas CRISPR agrupadas. Nuestro nuevo método proporciona mejores estadísticas con ideas más precisas, especialmente a medida que aumenta la profundidad de secuenciación. Esto hace que la técnica CRISPR-MIP sea una herramienta valiosa para complementar los métodos existentes sin agregar complejidad.

Además, hemos descubierto la influencia del contenido de GC en los resultados de PCR y destacado la necesidad de un análisis cuidadoso de este sesgo en los conjuntos de datos. Para mejorar la integridad del screening de CRISPR, animamos a los investigadores a adoptar mejores prácticas en sus configuraciones experimentales, incluyendo el uso de MIPs para evitar las trampas de la PCR tradicional.

#Conclusión

En conclusión, nuestro trabajo demuestra que CRISPR-MIP puede proporcionar resultados más fiables y sensibles en comparación con los métodos de PCR tradicionales. Si bien ambas técnicas identifican ideas genéticas valiosas, la implementación de MIPs ofrece una solución a muchas de las limitaciones que plantean los enfoques de amplificación convencionales, especialmente cuando se trata de robustez estadística y abordar sesgos en la representación de genes.

Creemos que a medida que la tecnología CRISPR continúa desarrollándose, incorporar métodos mejorados como CRISPR-MIP será crucial para avanzar en nuestra comprensión de las funciones genéticas y sus roles en varios procesos biológicos. A medida que obtenemos mejores ideas, podremos navegar por las complejidades de las interacciones genéticas y explorar aún más terapias para diferentes enfermedades.