Avances en la Ensamblaje Modular de Genes: MultiGreen

La tecnología de expresión génica juega un papel crucial en la investigación científica y en aplicaciones comerciales. En los primeros años, métodos simples para crear unidades de expresión génica eran suficientes. Estas unidades consisten en partes esenciales, incluyendo un promotor, una secuencia codificante y un terminador. Estos métodos se basaban en técnicas tradicionales de clonación donde las piezas de ADN se cortaban y pegaban manualmente. Sin embargo, a medida que crecieron las demandas de modificaciones genéticas más complejas, se necesitaron métodos más eficientes.

#Técnicas de Clonación Tradicionales

La clonación tradicional implica usar un backbone, que actúa como estructura de soporte, y varias herramientas conocidas como enzimas de restricción para cortar y unir segmentos de ADN. Cada unidad construida típicamente tiene cuatro componentes básicos:

• Promotor y 5' UTR: Esta es la parte que inicia la expresión génica.
• Secuencia Codificante: Aquí están las instrucciones reales para hacer una proteína.
• Terminator y 3' UTR: Esto señala el final de la expresión génica.
• Vector Backbone: Esto proporciona el marco para mantener todo junto.

Aunque los métodos tradicionales son útiles, tienen limitaciones, especialmente cuando múltiples genes necesitan ser ensamblados a la vez. A medida que los proyectos se volvieron más complicados, requiriendo más genes para ser editados o apilados, surgió la necesidad de mejores técnicas de clonación.

#Técnicas de Ensamblaje Modular

Para abordar la creciente complejidad, los científicos comenzaron a desarrollar técnicas de ensamblaje modular. Uno de los primeros enfoques fue la clonación Gateway. Este método usa enzimas especiales que pueden combinar con precisión segmentos de ADN. Permite el ensamblaje de varias piezas de ADN en un orden específico usando una serie de reacciones.

A pesar de sus ventajas, la clonación Gateway puede dejar piezas de ADN no deseadas, llamadas cicatrices, lo que puede complicar el producto final.

#Avances en Clonación: Clonación Golden Gate

La clonación Golden Gate surgió como un método más eficiente para el ensamblaje modular, permitiendo la construcción rápida de secuencias de ADN en un solo paso. Utiliza un tipo especial de enzima que hace cortes fuera de sus secuencias de reconocimiento, dejando pequeños trozos de ADN llamados "overhangs". Este método puede combinar múltiples fragmentos de ADN en una sola reacción, lo que hace que sea mucho más rápido y fácil para los científicos crear construcciones genéticas complejas.

Se han desarrollado varios sistemas basados en la clonación Golden Gate, cada uno con características únicas. Todos buscan optimizar los procesos organizando componentes para un ensamblaje más fácil. Factores clave que determinan cómo opera cada sistema incluyen la elección de enzimas, la estructura de los overhangs y cómo se organizan los componentes durante el ensamblaje.

#Dos Tareas Principales de los Sistemas de Ensamblaje Modular

Los sistemas modernos para ensamblaje modular deben lograr dos metas principales:

1. Ensamblar los componentes básicos, como promotores y secuencias codificantes, en unidades funcionales.
2. Combinar estas unidades funcionales en un solo vector multigénico capaz de operar como se espera.

Para cumplir con estas tareas, la mayoría de los sistemas dependen de múltiples etapas de ensamblaje, lo que permite flexibilidad y precisión.

#Etapas de Ensamblaje Nivel 0 y Nivel 1

La primera etapa de crear una unidad de expresión génica implica producir vectores "base" o "de entrada". Estos contienen un componente para la expresión génica, cada uno equipado con secuencias especializadas para facilitar el ensamblaje. Después de crear estos vectores de entrada, se realiza una segunda ronda de ensamblaje para producir unidades transcripcionales individuales, que representan las construcciones genéticas funcionales.

Estas unidades individuales pueden luego combinarse en un ensamblaje final, a menudo referido como un ensamblaje de “nivel 2”. También es posible combinar unidades iterativamente antes de crear el producto final, lo que permite una mayor complejidad en el diseño.

#Sistemas Modulares Versátiles

Han surgido diferentes sistemas que ayudan a optimizar el proceso de ensamblaje. Mientras que algunos sistemas se basan en un tipo de enzima, otros utilizan múltiples enzimas para mejorar la eficiencia. Un sistema de ensamblaje modular eficiente puede ahorrar tiempo y recursos al permitir a los científicos ajustar y intercambiar componentes rápidamente sin empezar desde cero.

Entre estos sistemas, GreenGate se destaca por su facilidad de uso y flexibilidad. Permite a los investigadores controlar todas las piezas cruciales necesarias para la expresión en plantas, lo que lo convierte en una opción popular en la biotecnología vegetal.

#Presentando MultiGreen: Una Nueva Solución

Para mejorar los métodos de ensamblaje existentes, se propuso el sistema MultiGreen. Este sistema se basa en las bases del kit original de GreenGate pero ofrece más versatilidad en el ensamblaje de múltiples componentes a la vez. MultiGreen consta de dos enfoques principales:

1. MultiGreen 1.0: Se centra en el ensamblaje en serie, permitiendo apilar los unidades genéticas paso a paso.
2. MultiGreen 2.0: Permite el ensamblaje en paralelo, lo que mejora significativamente la eficiencia y velocidad.

MultiGreen permite la integración de varias unidades transcripcionales en un solo plásmido mientras mantiene organización y claridad en el proceso de ensamblaje.

#MultiGreen 1.0: Ensamblaje en Serie

MultiGreen 1.0 se basa en el método GreenGate al introducir un componente adicional, conocido como el overhang H, que permite ensamblajes más complejos. Esta versión es especialmente útil cuando se requiere apilar muchas unidades transcripcionales en un orden específico.

El proceso emplea una serie de marcadores visuales que ayudan a los investigadores a identificar fácilmente qué componentes se han ensamblado con éxito en cada paso. Esto hace que la búsqueda de ensamblajes exitosos sea mucho más simple y reduce las probabilidades de errores.

#MultiGreen 2.0: Ensamblaje en Paralelo

En cambio, MultiGreen 2.0 lleva la eficiencia al siguiente nivel al permitir que varios ensamblajes ocurran simultáneamente. Con este método, hasta seis unidades diferentes pueden combinarse en una sola reacción, acelerando drásticamente el proceso de crear construcciones genéticas complejas.

Esta versión también utiliza estrategias únicas para alternar los tipos de resistencia a antibióticos utilizados, ayudando a prevenir la transferencia de material plásmido no deseado de una etapa a otra. El objetivo es facilitar a los investigadores adaptarse, cambiar o reutilizar componentes según sea necesario.

#Aplicaciones Prácticas de MultiGreen

Ambas versiones de MultiGreen han sido validadas a través de una serie de experimentos, mostrando su efectividad en la producción de construcciones genéticas funcionales. Por ejemplo, el proceso se ha utilizado para reconstruir vías para producir compuestos específicos, como pigmentos, en bacterias.

Además, el sistema MultiGreen mostró promesas en la creación de construcciones para su uso en plantas, permitiendo a los científicos desarrollar nuevos rasgos o características de manera más eficiente que los métodos anteriores.

#Pruebas y Resultados

Las pruebas iniciales realizadas con MultiGreen se centraron en producir un compuesto llamado protoviolaceinate, usando bacterias como organismo modelo. Se intentaron varios ensamblajes y se ajustaron las condiciones para optimizar el resultado.

Los resultados demostraron que MultiGreen podía lograr altas tasas de eficiencia en la producción de construcciones funcionales mientras hacía también más simple la búsqueda de ensamblajes exitosos.

De manera similar, el sistema MultiGreen se aplicó a un modelo de planta, confirmando su capacidad para facilitar la producción de productos deseados en un sistema eucariota.

#Conclusión

MultiGreen representa un avance emocionante sobre los métodos de clonación tradicionales, ofreciendo una forma más eficiente y flexible de crear construcciones genéticas complejas. Al permitir métodos de ensamblaje en serie y paralelo, permite a los investigadores trabajar de manera más efectiva e innovar más rápido.

A medida que crece la necesidad de ingeniería genética sofisticada, herramientas como MultiGreen se volverán cada vez más importantes, abriendo camino a nuevos descubrimientos en la mejora agrícola, medicina y más.