Desafíos y Perspectivas en la Secuenciación de Nueva Generación

La secuenciación de nueva generación (NGS) es una tecnología súper poderosa usada para analizar ADN. Permite a los científicos observar millones de variantes de ADN a la vez, haciéndola esencial para el diagnóstico genético. En Estados Unidos, muchos laboratorios y empresas han creado sus propias pruebas usando NGS para detectar enfermedades genéticas, generando ingresos importantes. Esta tecnología ha ayudado a identificar muchas mutaciones relacionadas con el cáncer y otras enfermedades.

A pesar de su uso generalizado, a veces NGS produce errores. Los reportes muestran que diferentes plataformas de NGS pueden tener resultados incorrectos que van desde el 0.26% hasta el 12.86%. Por ejemplo, un estudio sobre 20,000 muestras encontró una tasa de Falsos Positivos de alrededor del 1.3%. Esto significa que el 1.3% del tiempo, las pruebas identificaron erróneamente mutaciones que en realidad no estaban presentes. Por eso, los investigadores recomiendan confirmar estos hallazgos usando otro método llamado secuenciación Sanger.

Otra preocupación son los errores de Falsos Negativos, que ocurren cuando una prueba no detecta una mutación que sí está presente. En un estudio separado, la NGS de exoma completo encontró una tasa de falsos negativos del 40-45%. Esto sugiere que NGS podría perder muchas mutaciones, lo que puede llevar a diagnósticos erróneos o tratamientos inapropiados. Tanto las altas tasas de falsos positivos como de falsos negativos destacan la necesidad de una mejor evaluación de las pruebas de NGS para asegurar su fiabilidad.

#Supervisión Regulatoria de las Pruebas NGS

La Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) ha emitido directrices para mejorar la regulación de las pruebas de NGS en entornos clínicos. Los laboratorios de NGS en Estados Unidos son monitoreados por los Centros de Servicios de Medicare y Medicaid (CMS) y deben cumplir con las regulaciones de las Enmiendas de Mejora de Laboratorios Clínicos (CLIA).

Ha habido varios estudios enfocados en mantener la calidad de las tecnologías NGS. Proyectos como SEQC2 han aportado datos valiosos sobre la calidad de la detección de mutaciones en cáncer a través de diferentes métodos de secuenciación. Estos estudios enfatizan la importancia de tener muestras de referencia para una secuenciación precisa y también evalúan el desempeño de varias plataformas de NGS. En general, estos esfuerzos apoyan la necesidad de una mejor validación y Estandarización en las tecnologías NGS.

#Desafíos en las Pruebas de Tumores con NGS

La NGS dirigida (T-NGS) se ha vuelto común en entornos clínicos para detectar mutaciones en muestras de tumores. Esta información es crucial para elegir el tratamiento adecuado contra el cáncer. Sin embargo, identificar mutaciones en tumores es más complejo que hacer pruebas para enfermedades genéticas. Las células cancerosas a menudo tienen perfiles genéticos diversos dentro de un solo tumor, y las células normales pueden mezclarse, complicando el análisis.

Para mejorar la fiabilidad de T-NGS, los investigadores están evaluando los límites de detección y especificidad en la identificación de mutaciones. Una solución propuesta es usar mezclas de diferentes líneas celulares o agregar mutaciones conocidas para servir como estándares de referencia para el control de calidad. Estudios previos revelaron inconsistencias en la detección de variantes, indicando que se necesita más investigación en la validación de T-NGS.

#Evaluando la Sensibilidad de T-NGS

Para evaluar la fiabilidad de T-NGS de varios proveedores de servicios, se crearon DNAs de referencia estándar. Estos incluían una mezcla de ADN de un organismo específico y ADN de sangre humana. Al probar diferentes proporciones de estas mezclas, los investigadores buscaban determinar cuán sensibles eran las pruebas para detectar variantes.

La sensibilidad se refiere a la capacidad de una prueba para identificar correctamente resultados positivos. En este caso, significa detectar variantes presentes en las muestras de ADN de referencia. Los alelos informativos sirvieron como marcadores clave para probar la sensibilidad. Por ejemplo, algunos alelos eran nulos en un tipo de ADN y tenían una variante en el otro, lo que indicaba una mutación detectable.

En el proceso de prueba, se encontró que diferentes mezclas de ADN producían niveles de sensibilidad variados. Cuando los alelos informativos se diluían a un cierto porcentaje, la capacidad de T-NGS para detectarlos cambiaba. Si no se detectaba ninguno de los alelos a un cierto nivel de dilución, esto indicaba una menor sensibilidad para la prueba.

#Evaluando Errores de Falsos Negativos

Los errores de falsos negativos pueden ocurrir durante la evaluación de los resultados de T-NGS. Diferentes empresas que producen estas pruebas pueden dar resultados variados en la identificación de alelos informativos. Un estudio mostró que algunas empresas detectaron menos variantes de lo esperado, lo que indicó altas tasas de falsos negativos.

Para entender esto mejor, los investigadores examinaron los datos generados por T-NGS de múltiples empresas. Miraron de cerca los alelos que se esperaba que estuvieran presentes pero que no fueron detectados. Esta evaluación les permitió cuantificar las tasas de falsos negativos para diferentes muestras de mezcla.

Además, algunas empresas no lograron detectar consistentemente alelos informativos, destacando la variabilidad entre los resultados de T-NGS. Esta inconsistencia genera preocupaciones sobre la fiabilidad de estas pruebas en un entorno clínico.

#El Papel de la Bioinformática en T-NGS

La bioinformática se refiere al uso de software y computación para interpretar datos biológicos. En el contexto de T-NGS, la bioinformática juega un papel crucial en el análisis de los datos en crudo producidos por las máquinas de secuenciación. Diferentes empresas utilizan métodos de bioinformática únicos, lo que puede llevar a variaciones en los resultados que proporcionan.

Para investigar esto, los investigadores compararon el rendimiento de diferentes herramientas de bioinformática utilizadas por los proveedores de T-NGS. En algunos casos, el software alternativo llevó a una mejor correlación entre los resultados esperados y los hallazgos reales. Esto fue especialmente cierto cuando se emplearon herramientas específicas para analizar los datos, como el sistema Dragen, que difería de los métodos internos utilizados por algunas empresas.

A través de este análisis, se descubrió que las discrepancias en los resultados de T-NGS podrían surgir del procesamiento bioinformático en lugar de los datos en crudo generados durante la secuenciación. Si el análisis no se realiza correctamente, incluso datos de secuenciación de alta calidad pueden llevar a resultados engañosos.

#Evaluación de la Especificidad de T-NGS

Otro aspecto crítico de NGS es su especificidad, o la capacidad de identificar correctamente resultados negativos. En términos prácticos, esto significa que T-NGS no debería reportar una mutación a menos que esté realmente presente.

Los investigadores buscaron errores de falsos positivos en los resultados de T-NGS utilizando los mismos DNAs de referencia estándar empleados para la prueba de sensibilidad. Definieron los resultados falsos positivos como cualquier instancia en la que se reportara que una base estaba presente cuando en realidad no existía en las muestras de ADN.

El análisis reveló que diferentes empresas tenían tasas de falsos positivos significativamente variadas. Algunos métodos produjeron tasas de error bajas mientras que otros sobreinformaron significativamente mutaciones. Se observó que ciertos tipos de alelos, especialmente aquellos que no deberían haber estado presentes, frecuentemente generaban errores de falsos positivos.

La presencia de estos falsos positivos plantea preguntas significativas sobre la fiabilidad de los resultados de T-NGS. Métodos de evaluación efectivos que aborden estos problemas son cruciales para asegurar que los pacientes reciban diagnósticos precisos y tratamientos apropiados basados en sus perfiles genéticos.

#Alelos Propensos a Errores y Su Impacto

Los investigadores también identificaron alelos específicos propensos a generar resultados falsos positivos. Al analizar las posiciones de estos alelos problemáticos a través de mezclas de ADN, notaron que muchos errores provenían de las mismas ubicaciones.

Este descubrimiento indicó que la presencia de alelos propensos a errores podría sesgar los resultados generales de T-NGS. Eliminar estos de los análisis podría reducir drásticamente las tasas de falsos positivos. Sin embargo, se notaron variaciones entre diferentes lotes, lo que sugiere que incluso los alelos propensos a errores podrían comportarse de manera inconsistente según las condiciones experimentales.

Entender y gestionar estos sitios propensos a errores será importante para refinar las metodologías de T-NGS en el futuro. El análisis y la identificación continuos de estos sitios podrían ayudar a mejorar la precisión de las pruebas genéticas.

#El Impacto de los Métodos Analíticos en los Resultados

Los métodos utilizados para analizar datos genéticos afectan significativamente los resultados de las pruebas T-NGS. Las condiciones de análisis bioinformático, particularmente el uso de diferentes software, influyen en gran medida tanto en la sensibilidad como en la especificidad.

En algunos escenarios, usar condiciones Bioinformáticas más sensibles llevó a la detección de un mayor número de variantes. Sin embargo, esto vino con un aumento en las tasas de falsos positivos. En otras palabras, aunque se hizo más fácil identificar más variantes, muchas de estas identificadas eran incorrectas.

Los datos de varias empresas mostraron que aumentar la sensibilidad no siempre se correlacionaba con una mejor especificidad. En algunos casos, ajustes que llevaron a un ligero aumento en la sensibilidad resultaron en un aumento sustancial en el número de mutaciones identificadas incorrectamente.

Estos hallazgos subrayan la complejidad del análisis de datos de NGS. Sugiere que se debe encontrar un equilibrio entre sensibilidad y especificidad para asegurar que los resultados de T-NGS sean tanto precisos como beneficiosos para la práctica clínica.

#Recomendaciones para Mejorar el Rendimiento de T-NGS

Dada la variabilidad en sensibilidad y especificidad entre diferentes proveedores de T-NGS, se pueden esbozar recomendaciones para mejorar el rendimiento:

1. Estandarización: Es importante crear protocolos estandarizados para las pruebas de T-NGS. Esto podría ayudar a reducir la variabilidad entre laboratorios y mejorar la fiabilidad de los resultados.

2. Validación: La validación regular de los resultados de T-NGS utilizando estándares de referencia bien definidos puede ayudar a evaluar efectivamente tanto la sensibilidad como la especificidad.

3. Capacitación en Bioinformática: Una formación completa en métodos de bioinformática para el personal que analiza datos de T-NGS puede ayudar a reducir las discrepancias en la identificación de variantes.

4. Investigación: La investigación continua sobre las causas de resultados falsos negativos y falsos positivos proporcionará conocimientos cruciales que pueden mejorar la precisión de T-NGS.

5. Guías Clínicas: Establecer guías clínicas claras para la interpretación de resultados de T-NGS ayudaría a los profesionales de salud a tomar decisiones informadas basadas en los resultados de las pruebas.

#Conclusión

La secuenciación de nueva generación (NGS) es una herramienta importante en el campo de la genética. Permite el análisis rápido de grandes cantidades de ADN, ayudando así en el diagnóstico de diversas enfermedades, incluido el cáncer. Sin embargo, siguen existiendo desafíos para asegurar la precisión y fiabilidad de estas pruebas.

Identificar las limitaciones de T-NGS es crucial, particularmente en lo que respecta a las tasas de falsos positivos y falsos negativos. La variabilidad observada en los resultados entre diferentes proveedores de pruebas resalta la necesidad de una evaluación y refinamiento continuos de las metodologías.

A través del desarrollo de prácticas estandarizadas y un mejor análisis bioinformático, el campo puede mejorar la fiabilidad de T-NGS. En última instancia, esto conducirá a mejores resultados para los pacientes y contribuirá al avance de la medicina de precisión.