Avanzando la investigación del intestino con organoides porcinos

El tracto gastrointestinal (TGI) es clave para descomponer la comida, absorber nutrientes, eliminar desechos y mantener el cuerpo en equilibrio. El revestimiento del TGI juega un rol fundamental al controlar qué puede pasar a través de él, como nutrientes, sal y agua. Hay proteínas especiales llamadas proteínas de uniones estrechas que ayudan a mantener este revestimiento intacto y funcional. Estas proteínas actúan como una barrera y como un medio para que las cosas entren y salgan.

Una capa de moco, creada por células caliciformes, protege el revestimiento de gérmenes y daños físicos. Diferentes canales y transportadores ayudan a mover sustancias específicas dentro y fuera de las células. Los investigadores han estudiado principalmente el TGI usando modelos animales, siendo los cerdos una opción popular porque sus condiciones intestinales son similares a las de los humanos. Sin embargo, hay crecientes preocupaciones sobre la ética de usar animales para la investigación. Debido a esto, los científicos están recurriendo a métodos alternativos como cultivos celulares para estudiar el TGI.

#La Necesidad de Mejores Modelos

Aunque las líneas celulares son útiles para algunos estudios, a menudo se enfocan solo en un tipo de célula. El colon tiene muchos tipos de células diferentes, cada una con su propio rol. Para representar mejor estas diferencias, los investigadores han desarrollado modelos de Organoides, comenzando en 2009. Los organoides son agrupaciones de células que pueden crecer en diferentes tipos de células epiteliales y pueden renovarse. Cuando se cultivan en una capa bidimensional, estos organoides pueden ofrecer valiosos conocimientos para entender cómo funciona el intestino.

Un objetivo específico es examinar cómo funcionan los organoides de colon porcino a nivel celular, incluyendo cómo expresan ciertos genes en comparación con el tejido real. Este estudio también analizará cómo estos organoides transportan sustancias, lo cual es importante para su rol en la nutrición y la salud.

#Creando Organoides 3D y 2D

Para hacer organoides 3D, los investigadores primero aíslan criptas intestinales del tejido del colon de cerdo. Luego, los cultivan en un gel especial llamado Matrigel, que proporciona el ambiente adecuado para que los organoides se desarrollen. Los investigadores cambian cuidadosamente el medio de cultivo cada pocos días y descomponen los grupos que se vuelven demasiado grandes.

Para crear organoides 2D, toman organoides 3D establecidos y los descomponen en capas individuales. Después de tratarlos con ciertas enzimas, se cuentan las células y se colocan en insertos especiales de cultivo celular. Los investigadores reemplazan el medio cada dos días y miden cuán bien las células están formando conexiones entre sí.

#Analizando las Células

En el décimo día de crecimiento, los investigadores recolectan las células para analizar sus características. Usan varios métodos para estudiar la Expresión Génica de las proteínas de uniones estrechas, que son esenciales para mantener la función de barrera del revestimiento intestinal.

Usando kits específicos, los investigadores extraen ARN de las células para determinar cuántos de ciertos genes están siendo expresados. Comparando los cultivos de organoides 2D con el tejido nativo del colon, pueden ver si los organoides reflejan con precisión el tejido real.

#Monitoreando la Función de Barrera

Una forma de evaluar la salud de la capa celular es midiendo su Resistencia eléctrica, conocida como resistencia eléctrica transepitelial (TEER). Un TEER más alto indica una barrera más fuerte, lo cual es necesario para que el intestino funcione correctamente. En este estudio, los valores de TEER aumentaron con el tiempo, alcanzando un punto estable después del octavo día de crecimiento.

Usando microscopía electrónica, los investigadores pueden confirmar visualmente la integridad de la capa. Encuentran que la capa del organoide tiene microvellosidades bien formadas y células caliciformes que producen moco, ambos son características importantes de un colon sano.

#Expresión Génica en Organoides

El siguiente paso es evaluar si los organoides expresan genes clave que son cruciales para la función intestinal. Los investigadores se enfocan en los genes responsables de transportar sustancias importantes como sodio y cloruro. Encuentran que la expresión de estos genes en el cultivo de organoides 2D es comparable a la del tejido nativo.

Esta similitud es significativa porque muestra que los organoides pueden usarse para estudiar cómo funciona el intestino en términos de absorción y secreción de nutrientes. La expresión génica de mucinas, que son componentes importantes del moco, también mostró que no había diferencias significativas al comparar organoides con tejido nativo.

#Investigando la Fisiología del Transporte

Para estudiar mejor cómo se mueven las sustancias a través de la capa del organoide, los investigadores usaron una herramienta llamada cámara de Ussing. Este método les permite medir cómo cambian las corrientes eléctricas cuando se añaden ciertas sustancias. Por ejemplo, añadir glucosa a la capa del organoide causó un aumento en la corriente eléctrica, lo que indica que la glucosa estaba siendo absorbida correctamente, demostrando la actividad del transportador sodio-glucosa.

Los investigadores también probaron cómo otras sustancias influyeron en la corriente, como la forskolina, que aumenta la secreción de cloruro. Observaron que añadir forskolina llevó a cambios significativos en la corriente eléctrica, sugiriendo que los organoides pueden imitar la respuesta del tejido nativo.

#Impacto del Amiloride en los Canales de Sodio

El amiloride es un fármaco que puede bloquear la entrada de sodio a las células. Los investigadores probaron cómo diferentes concentraciones de amiloride afectaban la corriente eléctrica en los organoides. Encontraron que a ciertas concentraciones, el amiloride disminuyó efectivamente la corriente, mostrando que estaba influyendo en los canales de sodio como se esperaba.

Cuando los organoides fueron tratados previamente con aldosterona, una hormona que mejora la absorción de sodio, los investigadores querían ver si esto cambiaría la respuesta de la corriente. Sin embargo, encontraron que la adición de aldosterona no tuvo un efecto significativo en la corriente.

#La Importancia de la Función de Barrera

La capa epitelial en el colon es responsable de actuar como una barrera que controla lo que puede pasar mientras protege contra sustancias dañinas. La presencia de microvellosidades y células caliciformes en la capa del organoide es consistente con lo que se observa en un colon sano.

Esta función de barrera es crucial para la absorción de nutrientes y la prevención de infecciones. La expresión génica observada y la funcionalidad sugieren que los organoides son capaces de mantener una barrera selectiva, similar al tejido natural.

#Funcionalidad de Transportadores y Canales

Las proteínas de transporte y los canales juegan un papel importante en la función del colon. Los niveles de expresión de ciertas proteínas, como transportadores de sodio y cloruro, se mantuvieron consistentes entre los organoides y el tejido nativo del colon. Esta consistencia indica que los organoides pueden ser utilizados para estudios futuros.

Los investigadores usaron la cámara de Ussing para probar qué tan bien funcionaban estos transportadores en los cultivos de organoides. Encontraron que los organoides respondían a la glucosa de manera similar a como lo haría el tejido natural, aunque hubo algunas diferencias en la extensión de la respuesta.

#Conclusión

El objetivo de esta investigación fue crear un modelo in vitro que represente con precisión el colon porcino para estudiar sus propiedades funcionales. Los resultados muestran que el cultivo 2D de organoides de colon porcino puede formar una monocapa densa y saludable, al igual que el tejido natural. Los patrones de expresión génica son similares, lo que indica que los organoides son buenos modelos para la investigación.

Este estudio demuestra que tales modelos tienen el potencial de reemplazar las pruebas en animales para ciertos proyectos de investigación, alineándose con principios éticos que fomentan la reducción, sustitución y refinamiento del uso de animales en experimentos. Los hallazgos también proporcionan una base sólida para estudios futuros relacionados con la fisiología y enfermedad colónica.