Impacto do DTT no Aptâmero de Verde Malaquita em Sistemas PURA

Sistemas de síntese de proteínas sem células (CFPS) são métodos usados pra produzir proteínas sem usar células vivas. Tem dois tipos principais desses sistemas. O primeiro tipo é baseado em lisado celular, que significa que as proteínas e outras maquinarias celulares são extraídas de células e usadas diretamente pra produção de proteína. O segundo tipo envolve usar proteínas purificadas que são misturadas em quantidades conhecidas pra criar um sistema chamado PURE, que significa Síntese de Proteínas Usando Elementos Recombinantes Purificados. Também tem uma variante conhecida como OnePot PURE, onde todas as proteínas são combinadas e purificadas juntas.

#Entendendo os Sistemas PURE

Usar sistemas PURE permite que pesquisadores criem modelos que ajudam no desenvolvimento dos processos de síntese de proteínas. Isso significa que eles podem projetar, construir e testar novos circuitos genéticos ou células sintéticas de maneira mais eficaz. Nos últimos anos, pesquisadores criaram modelos pra simular como as proteínas são feitas em configurações PURE usando redes de reações químicas. Esses modelos foram melhorados ao incluir mais tipos de peptídeos e o processo de transcrição, que é como o RNA é produzido a partir do DNA.

Pra garantir que esses modelos sejam precisos, é importante monitorar tanto o processo de transcrição (a criação de RNA) quanto o de tradução (a criação de proteínas). A tradução pode ser monitorada usando proteínas fluorescentes, que brilham e indicam a produção de proteínas. No entanto, rastrear a transcrição é mais complicado, frequentemente dependendo de sequências especiais de RNA chamadas aptâmeros. Um desses aptâmeros é o aptâmero verde malaquita.

#Papel do Aptâmero Verde Malaquita

O aptâmero verde malaquita (MGapt) foi usado pela primeira vez pra controlar a expressão gênica em leveduras. Com o tempo, pesquisadores usaram o MGapt pra estudar como o RNA é produzido, como se comporta e as compensações entre transcrição e tradução em sistemas sem células. Tem muitos estudos que usaram o MGapt pra medir a produção de RNA em lisados celulares.

Surpreendentemente, nossa pesquisa com o MGapt no sistema PURExpress revelou comportamentos inesperados que podem explicar por que as leituras de MGapt não foram vistas como esperadas em CFPS PURO. Geralmente, aptâmeros como o MGapt podem distinguir entre moléculas semelhantes ou formas diferentes da mesma molécula. No entanto, o MGapt também pode se ligar a corantes semelhantes, o que pode confundir os resultados. Foi descoberto que o MGapt livre pode reduzir a quantidade de RNA que se dobra corretamente, e a presença de íons metálicos pode alterar como ele reage.

#O Impacto do DTT no MGapt

Neste trabalho, nos focamos em como os produtos químicos em sistemas PURE comerciais podem desestabilizar o MGapt, fazendo com que ele adote formas diferentes que mostram níveis variados de fluorescência. Vamos comparar nossas observações do MGapt em diferentes sistemas PURE, focando em como os tempos de saturação e mudanças dinâmicas ocorreram ao longo do tempo quando a transcrição não estava acontecendo. Além disso, vamos investigar os efeitos de um agente redutor chamado DTT no MGapt e fornecer dados experimentais pra apoiar nossas descobertas.

#Observações do MGapt em Diferentes Sistemas PURE

Pra checar a consistência do comportamento do MGapt em diferentes sistemas PURE, começamos analisando dois sistemas. Os sistemas PURE comerciais sugeriram um tempo de reação de 2-4 horas pra produção máxima de proteína. No entanto, percebemos que a fluorescência do MGapt não atingiu saturação após 2 horas. Nos nossos sistemas feitos em laboratório, tanto o PURExpress quanto o OnePot PURE mostraram comportamentos distintos na fluorescência do MGapt.

Quando analisamos a concentração do MGapt ao longo do tempo, descobrimos que no PURExpress a fluorescência do MGapt estabilizou em torno de seis horas, enquanto no OnePot PURE, saturou em torno de duas horas. Isso sugere que a produção de MGapt continuou por mais tempo no PURExpress, o que era curioso, já que a transcrição não deveria durar mais que a tradução.

#Composição Química e Efeito no MGapt

Após notar as diferenças, investigamos as composições químicas em ambos os sistemas. Descobrimos vários sais em um sistema que não estavam no outro, mas a principal diferença era o agente redutor usado - DTT no PURExpress e TCEP no OnePot PURE. O DTT é conhecido por ser menos estável e mais sensível em comparação com outros agentes como o TCEP.

Pra avaliar melhor como esses produtos químicos afetam o MGapt, realizamos experimentos com diferentes concentrações de DTT, TCEP e outros produtos químicos. Nossos resultados preliminares mostraram que apenas o TCEP e o pirofosfato (PPi) impactaram a fluorescência total do MGapt, enquanto o DTT pareceu não ter efeito.

#O Papel da Química Ambiental na Fluorescência do MGapt

Conforme continuamos nossos experimentos, vimos que a fluorescência do MGapt ao longo do tempo não era constante e que usar RNA apenas pro MGapt resultou em menor fluorescência do que quando combinado com um construto UTR1-deGFP. Isso foi interessante, porque quando normalizamos os resultados, ainda vimos a concentração do MGapt aumentando ao longo do tempo, mesmo sem a transcrição acontecendo.

Pra analisar melhor o efeito do DTT, realizamos experimentos com diferentes concentrações de DNA. Nossos achados revelaram que, enquanto a produção inicial de RNA variava, as concentrações normalizadas do MGapt convergiam ao longo do tempo, indicando novamente que a fluorescência estava ligada ao ambiente químico e não à produção de RNA em si.

#Inibição da Fluorescência do MGapt pelo DTT

Nossos resultados sugerem que o MGapt passa por vários estados influenciados pelas concentrações de DTT. Construímos um modelo pra mostrar como o DTT altera o MGapt, convertendo-o de uma forma brilhante e fluorescente pra uma menos fluorescente. Esse modelo destaca como o DTT poderia inibir a fluorescência do MGapt e ser um fator em seu comportamento em sistemas PURE comerciais.

Usamos um programa de computador pra simular esse modelo e analisar como o DTT interage com o MGapt. Monitorando mudanças na fluorescência, conseguimos entender melhor como medir a produção de RNA com precisão.

#Validando o Modelo com Dados Experimentais

Pra avaliar a confiabilidade do nosso modelo, realizamos testes com diferentes concentrações de RNA e monitoramos ao longo do tempo. Observamos que as concentrações de MGapt previstas eram precisas para níveis mais baixos de RNA, sugerindo que o DTT poderia agir efetivamente como um proxy pra entender o comportamento do MGapt em reações de síntese de proteínas.

Nossos achados indicam que a composição química dos sistemas PURE comerciais afeta significativamente as leituras do MGapt. O DTT, presente em alguns sistemas mas não em outros, desempenha um papel na redução da fluorescência do MGapt ao induzir alterações em seu estado. Essa degradação ao longo do tempo pode permitir que o MGapt recupere sua fluorescência brilhante, influenciando como interpretamos dados desses sistemas.

#Conclusão

Através desses estudos, aprendemos que as características de fluorescência do MGapt estão ligadas ao ambiente químico dos sistemas PURE usados. A presença do DTT, especificamente, parece dificultar as leituras do MGapt, levando a possíveis mal-entendidos nas medições da produção de RNA. Nosso modelo oferece uma forma de prever como o MGapt se comporta sob diferentes condições, abrindo caminho pra avaliações mais precisas da síntese de proteínas em sistemas sem células.

No futuro, incentivamos uma exploração mais profunda de outros aptâmeros e seu comportamento de fluorescência, o que poderia ajudar a identificar outros fatores que influenciam as medições de RNA em vários sistemas. Essa abordagem ajudará a desenvolver melhores metodologias para usar sistemas sem células em pesquisa e aplicações industriais.