Avanços na Análise de Proteínas Usando BONCAT

A análise de espectrometria de massa (MS) ajuda os cientistas a estudarem proteínas em amostras biológicas complexas. Essa abordagem permitiu que os pesquisadores descobrissem mudanças importantes nos níveis de proteínas devido a várias atividades biológicas. No entanto, ao estudar proteínas em tecidos ou células, identificar pequenas mudanças pode ser um desafio. Um método para lidar com esse problema se chama Biorthogonal Noncanonical Amino Acid Tagging (BONCAT), que fornece uma maneira de rotular proteínas produzidas durante um período específico.

#O que é BONCAT?

O BONCAT usa aminoácidos especiais que não são encontrados naturalmente nas proteínas. Esses aminoácidos são usados para marcar novas proteínas feitas durante um período específico. A ideia é que as proteínas recém-fabricadas vão reagir de maneira diferente às mudanças biológicas em comparação com as proteínas mais antigas. Ao focar nessas novas proteínas, os pesquisadores podem evitar a confusão que vem da mistura de proteínas velhas e novas, facilitando a visualização de mudanças que poderiam passar batido.

O aminoácido não canônico mais comum usado para esse método é o Azidohomoalanina (AHA). Quando os pesquisadores adicionam AHA às células, ele é incorporado nas novas proteínas em vez do aminoácido regular metionina, que está naturalmente presente em muitas proteínas. Isso acontece porque a metionina compete com a AHA para ser incorporada nas proteínas. Como a metionina é essencial para a sobrevivência celular, os pesquisadores não conseguem removê-la completamente durante os experimentos, mas podem reduzir seus níveis para permitir que a AHA seja usada de forma mais eficaz.

#Usando AHA em Vários Organismos

Originalmente, a AHA era usada principalmente em células cultivadas, mas desde então foi aplicada em estudos envolvendo organismos mais complexos, como o verme C.elegans e camundongos. Pesquisas mostram que as proteínas marcadas com AHA se comportam de maneira semelhante às suas contrapartes naturais. Isso significa que elas têm a mesma estrutura, estabilidade e função. Estudos descobriram que essas proteínas AHA respondem às mudanças biológicas assim como as proteínas não modificadas.

Outro aminoácido não canônico que oferece seletividade é a Azidonorleucina (ANL). A ANL precisa de uma versão modificada da metionina tRNA sintase para ser corretamente incorporada nas proteínas. Esse método permite que os cientistas foquem em células específicas ao estudar proteínas, oferecendo insights mais direcionados.

#O Protocolo DidBIT

Para melhorar a análise das proteínas usando AHA, nossa pesquisa utilizou uma estratégia chamada DidBIT (Detecção Direta de Tags que Contêm Biotina). No DidBIT, os peptídeos marcados com AHA são enriquecidos usando contas especiais que se ligam fortemente à biotina. Depois de grudar os peptídeos nessas contas, os pesquisadores podem lavar tudo que não é necessário e focar apenas nos peptídeos marcados. Essa etapa é crucial para aumentar a sensibilidade da análise, permitindo detectar quantidades menores de proteínas.

Nos nossos experimentos, comparamos o desempenho de dois tipos de tags de biotina: uma que pode ser quebrada e uma que não pode. Ao usar diferentes quantidades de tecido cerebral marcado com AHA, conseguimos ver qual método funcionava melhor.

#Métodos

Cultivamos dois tipos de células a uma temperatura e níveis de CO2 controlados. Após preparar essas células, nós as transfectamos com um gene modificado para introduzir a mMetRS. Isso introduziu o método modificado para incorporar os aminoácidos especiais.

Depois que as células foram tratadas com AHA ou ANL, realizamos uma série de etapas para extrair e analisar as proteínas. Isso envolveu usar um sonificador para abrir as células e misturar as proteínas com tampões de amostra. Em seguida, usamos eletroforese para separar as proteínas com base em seu tamanho e, depois, transferimos para membranas especiais para mais análise.

Depois disso, rotulamos as proteínas e as quantificamos usando um método chamado separação celular ativada por fluorescência (FACS). Esse método nos permitiu isolar células que absorveram com sucesso os genes modificados.

Para experimentos com animais, mantivemos camundongos em ambientes controlados. Os animais foram alimentados com dietas contendo AHA ou ANL. Após o tratamento, coletamos os cérebros para analisar como esses aminoácidos não canônicos foram incorporados nas proteínas.

#Resultados: Comparando AHA e ANL

Na nossa análise, descobrimos que a incorporação de AHA foi praticamente eliminada na presença de metionina, enquanto a ANL mostrou apenas uma leve redução. Isso indicou que a incorporação de ANL foi mais eficiente que a de AHA na presença de metionina. No entanto, de maneira geral, a AHA foi incorporada nas proteínas de forma mais bem-sucedida do que a ANL.

Nossos testes mostraram que a tag de biotina que pode ser quebrada (DADPS) foi mais eficaz em detectar peptídeos marcados com AHA em comparação com a tag de biotina que não pode ser quebrada (UnC). Quando analisamos diferentes quantidades de tecido cerebral, a DADPS identificou consistentemente mais peptídeos do que a UnC, destacando sua sensibilidade.

#O Papel da Rotulação TMT

Nós também investigamos se a TMT, uma técnica de rotulação usada para quantificar proteínas, afetaria nossos resultados com peptídeos marcados com AHA. Quando testamos isso com ambas as tags de biotina, encontramos que a DADPS ainda se saiu melhor que a UnC, identificando mais peptídeos AHA mesmo quando a TMT foi aplicada. Isso sugere que a DADPS é compatível com técnicas de quantificação de proteínas enquanto mantém sua eficácia.

#Diferenças Entre Peptídeos DADPS e UnC

Ao examinar os dados de nossos experimentos, notamos diferenças significativas entre os dois tipos de peptídeos. Os peptídeos DADPS eluíram de forma mais eficiente das contas em comparação com os peptídeos UnC, o que pode ser uma razão para o melhor desempenho da DADPS.

Além disso, descobrimos que os peptídeos DADPS mostraram uma distribuição mais ampla no perfil cromatográfico, significando que se separaram melhor durante a análise. Em contraste, os peptídeos UnC apareceram mais tarde, indicando que podem ter sido menos estáveis ou se fragmentado mal durante a análise de MS.

Essa diferença de fragmentação foi evidente em nosso sistema de pontuação para identificação de peptídeos. Os peptídeos DADPS receberam notas mais altas, o que significa que foram detectados de forma mais confiável do que os peptídeos maiores UnC, que tiveram dificuldades devido ao seu tamanho.

#Resumo e Conclusão

Resumindo, a abordagem BONCAT usando DADPS para rotular proteínas oferece uma sensibilidade melhorada para detectar proteínas recém-sintetizadas em comparação com métodos tradicionais. A eficiência da AHA na incorporação de proteínas, mesmo na presença de metionina, destaca sua utilidade para estudar a dinâmica de proteínas nas células.

Ao aprimorar nossos métodos e comparar diferentes tags de biotina, podemos aumentar nossa compreensão da função das proteínas em sistemas biológicos complexos. Esse trabalho abre caminho para estudos mais detalhados das proteínas em vários organismos e condições, potencialmente levando a novos insights na pesquisa biológica e na medicina.