Novo Método para Estudar Colesterol e Membranas

As membranas biológicas são estruturas importantes em todas as células vivas. Elas têm propriedades especiais como fluidez, espessura e quanto elas podem ser comprimidas. Essas propriedades têm um grande papel em como as Proteínas funcionam dentro das membranas. Um lipídio chave encontrado em muitas células animais é o Colesterol. Ele ajuda a regular como as membranas se comportam, incluindo sua rigidez e como as substâncias podem passar por elas.

O colesterol não está distribuído uniformemente na membrana; ele é encontrado em quantidades diferentes de cada lado. Mudando como os lipídios estão empacotados, o colesterol pode deixar a membrana mais espessa e menos compressível. Quando as partes de uma proteína que atravessam a membrana não combinam com a espessura da membrana, as proteínas tendem a se aglomerar. Isso ajuda a reduzir a tensão energética na membrana.

Algumas proteínas, como as lipid scramblases, aproveitam essas distorções na membrana para facilitar a troca de lipídios. Essas proteínas podem mover substâncias semelhantes a gorduras de um lado da membrana para o outro, ou podem ajudar a mover partes delas que amam água através do núcleo gorduroso da membrana. A capacidade de uma membrana ser comprimida parece influenciar como essas proteínas funcionam.

Porém, é difícil descobrir como cada propriedade da membrana é relevante para uma proteína específica. Isso acontece porque as propriedades das membranas estão conectadas, e mudar uma pode afetar as outras. Além disso, muitas propriedades das membranas não podem ser medidas facilmente. Finalmente, reconstituir proteínas de membrana em membranas complexas que têm colesterol e não são uniformes é um grande desafio. Isso é especialmente verdadeiro para proteínas que dependem da distorção da membrana para funcionar corretamente. Colocar proteínas com espessura incompatível em membranas ricas em colesterol pode causar problemas, como aglomeração e distribuição desigual de proteínas e lipídios.

Para enfrentar esses desafios, novas metodologias são necessárias para estudar proteínas de membrana em condições controladas.

#Nova Abordagem Experimental

A gente desenvolveu um novo método para modificar os níveis de colesterol em Lipossomos pequenos, que são bolhas feitas de lipídios. Usamos uma substância chamada metil-β-ciclodextrina (mβCD) em um setup de diálise. O mβCD é um açúcar que consegue "agarrar" o colesterol, então pode entregar ou retirar colesterol dos lipossomos.

Usar o mβCD nos permite manter os lipossomos em uma área separada enquanto mudamos os níveis de colesterol ao redor deles. Isso facilita remover o mβCD depois que entregamos colesterol, permitindo medir como o colesterol é inserido nos lipossomos.

Começamos testando esse método em lipossomos feitos de um lipídio comum chamado POPC. Colocamos os lipossomos em um banho com mβCD carregado de colesterol. Medimos quanto colesterol era absorvido pelos lipossomos ao longo do tempo. Descobrimos que a quantidade de colesterol aumentou significativamente depois de algumas horas.

Também testamos se era possível retirar colesterol dos lipossomos usando mβCD vazio em um novo banho. Novamente, observamos uma clara diminuição nos níveis de colesterol durante esse processo.

#Nota sobre Espectroscopia C-Laurdan

Para fazer isso, utilizamos um corante especial chamado C-Laurdan que muda de cor dependendo de quão apertados os lipídios estão empacotados dentro da membrana. Essa mudança de cor nos dá ideias sobre como o colesterol afeta a estrutura da membrana.

#Mantendo os Lipossomos Inteiros

Ao usar mβCD, é crucial que os lipossomos não se quebrem. Se adicionar muito mβCD, ele pode dissolver completamente os lipossomos. Em nossos experimentos, mantivemos a proporção de lipídios para mβCD baixa o suficiente para que os lipossomos permanecessem intactos durante a troca de colesterol.

Para verificar a integridade dos lipossomos, os carregamos com um corante fluorescente chamado carboxifluoresceína (CF). Enquanto os lipossomos permanecessem inteiros, o corante ficava contido e não fluorescia muito. Se a membrana quebrasse, a fluorescência aumentaria. Durante nossos experimentos, vimos apenas pequenas mudanças na fluorescência, sugerindo que os lipossomos permaneceram inteiros.

#Taxa de Entrega de Colesterol

Depois, analisamos como mudar a temperatura afetava a velocidade com que o colesterol podia ser entregue aos lipossomos. Testamos em diferentes temperaturas e descobrimos que em temperaturas mais altas, o colesterol entrava nos lipossomos muito mais rápido.

Também verificamos como o tamanho dos buracos na membrana de diálise (que permite que o mβCD passe) impactava a entrega de colesterol. Buracos maiores permitiram uma transferência mais rápida de colesterol, enquanto buracos menores a desaceleraram.

#Transferindo Colesterol Entre Lipossomos

Depois, queríamos ver se nosso setup poderia ser usado para transferir colesterol entre dois conjuntos diferentes de lipossomos. Usamos uma versão fluorescente do colesterol chamada deidroergosterol (DHE) para acompanhar a transferência. Enquanto movíamos DHE de lipossomos doadores para lipossomos receptores, vimos uma diminuição na fluorescência do doador e um aumento na fluorescência do receptor.

Isso indicou que nosso método permitia uma transferência eficaz de esteróis entre diferentes lipossomos, destacando a versatilidade do nosso setup experimental.

#Analisando a Oligomerização de Proteínas

Também estávamos interessados em como mudar os níveis de colesterol poderia afetar proteínas que atravessam a membrana. Focamos em uma proteína específica chamada Ire1, que está envolvida em perceber mudanças na membrana. Ela pode se dimerizar, ou seja, duas de suas unidades se juntam, quando a membrana se torna mais rígida ou espessa.

Usando nosso setup para ajustar os níveis de colesterol em lipossomos contendo Ire1, observamos que, à medida que o colesterol era introduzido, a Dimerização de Ire1 aumentou. Quando removemos o colesterol novamente, a dimerização diminuiu. Isso mostra que a presença de colesterol pode influenciar bastante como essas proteínas se comportam.

#Vantagens do Nosso Método

Nossa técnica oferece uma maneira fácil de modificar os níveis de colesterol em lipossomos, que pode ser útil para vários estudos científicos. Alguns benefícios do nosso método incluem:

1. Alta Recuperação: Podemos facilmente recuperar os lipossomos após os experimentos.
2. Separação de Amostras: As diferentes populações de lipossomos permanecem separadas durante todo o experimento.
3. Versatilidade: Nossa abordagem pode funcionar com diferentes tipos de membranas e não é limitada apenas a lipossomos.

#Limitações a Considerar

Embora esse método tenha muitas vantagens, há algumas limitações. Primeiro, a troca de lipídios leva tempo, então apenas proteínas estáveis que conseguem lidar com durações mais longas podem ser estudadas. Segundo, pode haver alguma transferência não intencional de lipídios diferentes junto com o colesterol.

#Conclusão

Estabelecemos um novo método que permite a modificação reversível dos níveis de colesterol em lipossomos. Esse método pode ajudar pesquisadores a estudar o impacto do colesterol em proteínas de membrana de uma maneira controlada. Ao ajustar os níveis de colesterol, os cientistas podem obter insights sobre como as proteínas se comportam em diferentes ambientes de membrana. Esse avanço melhora nossa capacidade de compreender a dinâmica das membranas e as interações das proteínas, que são cruciais para muitos processos biológicos.