Avanços nas Técnicas de Expressão de Complexos de Proteínas

Proteínas geralmente trabalham em grupos conhecidos como complexos. Esses complexos podem ter várias partes, e cada parte é uma proteína diferente. Pra entender melhor esses complexos, os cientistas muitas vezes precisam ver suas estruturas. Um método pra isso é chamado de criomicroscopia eletrônica. Pra estudar essas estruturas de perto, eles precisam primeiro produzir e purificar os Complexos de Proteínas.

Quando os complexos de proteínas vêm de organismos vivos com células complexas, chamados de eucariotos, os cientistas geralmente têm que cultivá-los em organismos semelhantes. Dois sistemas comuns usados pra isso são o sistema de baculovírus e levedura. Cada um tem seus pontos fortes e fracos, dependendo do que os pesquisadores precisam.

#Sistemas de Expressão de Baculovírus

Existem vários métodos dentro do sistema de baculovírus pra criar proteínas recombinantes, que são proteínas feitas a partir de um gene específico. Um método bem conhecido é chamado de sistema Bac-to-Bac. Esse método permite que os cientistas clonar até dois genes de cada vez em um Vetor especial. Esse vetor é então inserido no DNA do baculovírus, que ajuda a produzir as proteínas em células de insetos.

Pra complexos de proteínas que precisam de mais de duas partes, os pesquisadores costumam usar vários vírus pra infectar as células ao mesmo tempo. Embora esse método possa funcionar pra complexos com até cinco proteínas, ele geralmente se torna mais difícil e menos confiável com mais partes. Nesses casos, usar vetores que podem segurar vários genes juntos costuma ser melhor.

#Sistemas de Vetores Multigenes

Existem vários sistemas pra criar vetores que podem lidar com múltiplos genes no sistema de baculovírus. Um deles é o MultiBac, que combina vários genes em um único vetor. Outro sistema, chamado BiGBac, permite a construção de até 25 genes em um plasmídeo. Depois tem o GoldenBac, que simplifica o processo preparando os genes individuais apenas uma vez no começo.

Todos esses sistemas requerem o processo de PCR ou Montagem de Gibson pra trabalhar com os genes. No entanto, esses métodos podem ficar complicados, especialmente se os genes usados têm características desafiadoras. Além disso, muitos desses vetores não vêm com tags que ajudam a identificar as proteínas, resultando em etapas de clonagem mais complicadas e aumentando o tempo e os custos pros cientistas.

#Clonagem Modular (MoClo)

Os pesquisadores já enfrentaram o problema de construir vetores com múltiplos genes através de um método chamado clonagem modular (MoClo). No MoClo, os cientistas usam elementos de DNA separados chamados "partes" pra construir estruturas mais complexas conhecidas como "dispositivos." Cada parte pode ser qualquer coisa, como um pedaço de um gene, uma tag ou um promotor que controla a expressão do gene.

Uma vez que uma parte é criada, ela pode ser reutilizada em outros projetos ou compartilhada com outros laboratórios. As partes são cortadas usando enzimas especiais, e suas extremidades são desenhadas pra se encaixar, permitindo uma montagem fácil em construções funcionais. Esse processo pode ser repetido, tornando possível criar versões cada vez mais complexas de construções de forma rápida e econômica.

#MoClo Baculo: Uma Nova Ferramenta pra Expressão de Proteínas

O método MoClo Baculo foi desenvolvido pra criar vetores multigênicos pra expressar proteínas tanto no sistema de baculovírus quanto na levedura. Esse método depende apenas da montagem Golden Gate, o que significa que evita as complicações que vêm com PCR e outras técnicas. Como resultado, as chances de introduzir erros no DNA são extremamente baixas, e os cientistas não precisam sequenciar cada passo, economizando tempo e recursos valiosos.

O MoClo Baculo pode expressar até seis proteínas de uma única construção, e permite modificações fáceis. Por causa de sua flexibilidade, esse método foi criado pra ajudar a criar sistemas de expressão adaptados às necessidades específicas da pesquisa. Com esse método, os cientistas podem construir vários vetores de expressão rapidamente.

#Desenhando o MoClo Baculo

Pra tornar o MoClo Baculo eficaz, a equipe se inspirou no Kit de Ferramentas de Levedura MoClo e adaptou pra ser compatível com o sistema de baculovírus. Eles desenharam várias partes, como conectores, promotores, sequências codificadoras, tags e terminadores. Cada parte tem um propósito específico e pode ser misturada e combinada com base nos objetivos da pesquisa.

Uma melhoria chave no MoClo Baculo é que os pesquisadores podem usar a mesma sequência codificadora com tags diferentes. Antigamente, pra fazer vetores pra proteínas com e sem tags, os cientistas tinham que criar partes separadas. Essa nova abordagem ajuda a agilizar o processo.

Os cientistas também se certificarão de criar partes compatíveis com ambos os sistemas, baculovírus e levedura, permitindo que os pesquisadores mudem entre os dois conforme necessário. Eles incluíram diferentes opções de promotores e desenharam tags que melhoram a purificação de proteínas enquanto garantem que suas estruturas permaneçam intactas.

#Melhorando a Compatibilidade com Baculovírus

Pra garantir que o MoClo Baculo funcione bem com o sistema de baculovírus, a equipe modificou partes de um vetor de expressão existente. Eles analisaram várias sequências usadas em sistemas de expressão de baculovírus pra identificar módulos comumente usados que poderiam ser melhorados sem afetar o desempenho.

Novas partes foram criadas pra ser compatíveis com o sistema Bac-to-Bac. Isso garante que os vetores finais de expressão incluam todas as ferramentas necessárias pra expressar e recombinar as proteínas. Além disso, eles também investigaram como otimizar as sequências pra evitar locais de corte indesejados.

#Construindo o Sistema MoClo Baculo

O sistema MoClo Baculo permite que os cientistas criem múltiplos vetores de expressão com base nas necessidades específicas deles. Juntando várias partes, os pesquisadores podem criar vetores prontos pra expressar um complexo de proteínas completo ou várias subunidades.

Múltiplos níveis de plasmídeos são criados durante esse processo, começando com o Nível 0 que segura partes individuais, passando pro Nível 1 que pode expressar uma única proteína, e finalmente pro Nível 2 que pode combinar várias proteínas. O processo é agilizado usando enzimas específicas que cortam o DNA em lugares designados, resultando nas construções desejadas.

#Vetores de Expressão de Levedura

Construir vetores de expressão de levedura é bem parecido com criar vetores de baculovírus. As mesmas partes podem ser usadas pra ambos os sistemas, mas pequenas mudanças são necessárias pra se adaptar às exigências da levedura. Essa flexibilidade permite que os pesquisadores escolham o melhor sistema de expressão pros projetos específicos deles.

#Prova de Conceito: Criando Vetores Multigênicos

Pra demonstrar as capacidades do MoClo Baculo, a equipe criou vários vetores diferentes que expressam subunidades de proteínas do complexo PRC2. Esse processo confirmou que o sistema funciona de forma confiável, com altas taxas de sucesso e complicações mínimas.

Eles demonstraram isso montando plasmas de Nível 1 pra cada subunidade e depois construindo vetores de Nível 2, que combinavam todos os componentes necessários. Cada etapa do caminho foi validada através de triagens, garantindo que as sequências montadas fossem precisas e prontas pra uso.

#Expressão e Purificação de Proteínas

Depois de construir os vetores multigênicos pro complexo PRC2, o próximo passo foi expressar e purificar as proteínas. Usando o sistema de baculovírus, eles conseguiram produzir altas quantidades do complexo PRC2 e suas variantes, que foram então processadas através de métodos de purificação. As proteínas resultantes estavam bem estruturadas e atendiam aos padrões de qualidade esperados.

A equipe também queria ver se as proteínas eram funcionais, e descobriram que os complexos PRC2 mostraram a atividade enzimática correta após a purificação. Comparações foram feitas entre os complexos produzidos por diferentes métodos, todas confirmando que o sistema MoClo Baculo podia produzir proteínas de forma eficiente e eficaz.

#Comparando Sistemas de Expressão

Usar tanto os sistemas de baculovírus quanto os de levedura tem seus benefícios; o baculovírus geralmente rende mais proteína, mas o sistema de levedura pode ser mais rápido e menos caro. Usando o MoClo Baculo, os pesquisadores podem testar e otimizar suas construções na levedura antes de mudar pra baculovírus pra produção em maior escala de proteínas.

Ao permitir flexibilidade na construção e modificação de vetores sem as complicações habituais, o MoClo Baculo se apresenta como uma ferramenta valiosa pros pesquisadores em expressão de proteínas.

#Conclusão

O MoClo Baculo oferece uma solução prática pra criar sistemas de expressão multigênicos que podem funcionar em diferentes plataformas. Seu design modular permite que os pesquisadores construam vetores rapidamente, modifiquem facilmente e produzam proteínas de forma eficaz. Ao reduzir tempo, custo e complexidade, esse método melhora a capacidade geral dos cientistas em estudar e entender complexos de proteínas, abrindo caminho pra futuras descobertas em várias áreas.

Essa abordagem inovadora pra expressão e purificação de proteínas promete beneficiar não só a biologia estrutural, mas também muitas outras aplicações em bioquímica e biofísica, ajudando finalmente no entendimento mais amplo da maquinaria celular necessária pra vida.