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# Ciências da saúde# Malattie infettive (eccetto HIV/AIDS)

Nova ferramenta detecta resistência a medicamentos contra a malária

O Pf-SMARRT melhora a detecção da resistência ao tratamento da malária em Camarões.

Jonathan J Juliano, J. M. Sadler, A. Simkin, V. P. K. Tchuenkam, I. Gerdes Gyuricza, A. Fola, K. Wamae, A. Assefa, K. Niare, K. Thwai, S. J. White, W. Moss, R. Dinglasan, S. Nsango, C. B. Tume, J. B. Parr, I. M. Ali, J. A. Bailey

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A malária é uma doença séria causada por parasitas transmitidos por picadas de mosquito. A luta contra a malária tá enfrentando desafios com a resistência crescente desses parasitas aos tratamentos, principalmente na África. Apesar dos esforços pra controlar a malária, a situação piorou em algumas áreas. Em 2022, teve milhões de casos de malária no mundo, com um número significativo de mortes. Uma tendência preocupante é a emergência da resistência parcial à artemisinina, um remédio chave usado no tratamento da malária, que já foi observada na África e ligada a falhas de tratamento no Sudeste Asiático.

Pra acompanhar como os tratamentos estão funcionando, os cientistas tradicionalmente realizavam estudos que observavam os parasitas em pacientes vivos ou mediam como eles respondiam aos remédios em laboratório. Porém, agora eles desenvolveram uma nova abordagem chamada vigilância molecular da malária (MMS), que foca em identificar Mutações específicas no DNA dos parasitas. Esse método permite um rastreamento mais eficaz da resistência aos medicamentos, já que certas mutações se tornam comuns em grandes populações.

Necessidade de Melhores Métodos de Detecção

Com o surgimento de mais mutações em diferentes genes, os cientistas precisam de maneiras mais rápidas e simples pra testar essas mutações. Um método promissor que ganhou popularidade é chamado de sequenciamento profundo direcionado. Essa técnica permite que os pesquisadores se concentrem em áreas específicas do DNA do parasita pra procurar mutações que conferem resistência aos tratamentos.

Usando diferentes técnicas, os cientistas podem amplificar (ou fazer muitas cópias de) certas regiões do DNA em laboratório. Dois métodos comuns pra isso são a PCR multiplex, que amplifica muitos alvos de uma vez, e as sondas de inversão molecular (MIPs), que são projetadas pra capturar muitas sequências de DNA. No entanto, enquanto as MIPs podem analisar muitos alvos com eficácia, elas podem perder alguns casos quando o número de parasitas é muito baixo em comparação com os painéis de PCR multiplex.

Introduzindo um Novo Método de Teste

Pra resolver a necessidade de melhor detecção da resistência a medicamentos nos parasitas da malária, foi desenvolvido uma nova ferramenta chamada Pf-SMARRT. Essa ferramenta é projetada pra analisar muitas mutações relacionadas à resistência a medicamentos da malária e estudar como diferentes cepas do parasita estão conectadas.

O Pf-SMARRT usa materiais comuns que podem ser facilmente encontrados e não requer produtos especializados. Os métodos necessários pra usar o Pf-SMARRT são disponibilizados abertamente, permitindo que laboratórios em várias localidades adotem essa tecnologia. A equipe validou o Pf-SMARRT usando Amostras com características conhecidas antes de aplicá-lo em amostras do mundo real.

Visão Geral do Estudo

O principal objetivo desse estudo foi usar o Pf-SMARRT pra analisar amostras coletadas de pacientes em Dschang, Camarões. Um total de 100 amostras foi escolhida de um grupo maior de pacientes diagnosticados com malária. Os pesquisadores usaram essas amostras pra avaliar várias características-chave, incluindo resistência a tratamentos, complexidade das infecções (ou seja, quantas cepas diferentes estão presentes em um único paciente) e relações genéticas entre as amostras.

Os pesquisadores compararam a eficácia do Pf-SMARRT com outro método chamado MIPs, que já foi usado em muitos estudos. Eles analisaram quão bem cada método identificou mutações ligadas à resistência a medicamentos e quão precisamente avaliaram as relações entre diferentes cepas de parasitas.

Coleta e Teste das Amostras

As amostras dos pacientes foram coletadas de indivíduos com febre, mas sem sintomas graves de malária. Pessoas que tinham tomado tratamentos recentes pra malária foram excluídas. Cada participante forneceu uma gota de sangue seca, o que significa que a amostra de sangue foi seca em um cartão especial pra teste. O estudo recebeu aprovação de um comitê de ética pra garantir que todos os participantes fossem informados e dessem consentimento.

Os pesquisadores usaram um método chamado PCR em tempo real pra determinar o nível de parasitas nas amostras. Essa técnica ajudou a identificar amostras com níveis significativos de parasitas, que poderiam fornecer resultados confiáveis pro estudo.

Realizando os Testes

Uma vez que as amostras foram coletadas, os pesquisadores sequenciaram o DNA de cada amostra usando o Pf-SMARRT. Eles amplificaram o DNA pra identificar mutações específicas ligadas à resistência a medicamentos e avaliaram a variação genética geral presente nas amostras.

O Pf-SMARRT foca em várias mutações importantes relacionadas à resistência, incluindo aquelas encontradas em genes que são conhecidos por contribuir pra como os parasitas respondem a diferentes tratamentos. O processo de teste envolveu várias etapas, incluindo a preparação das amostras, amplificação do DNA, purificação e, em seguida, sequenciamento usando tecnologia avançada pra ler o código do DNA.

Principais Descobertas

Ao analisar as amostras, os pesquisadores conseguiram determinar a presença de várias mutações associadas à resistência a tratamentos. Notavelmente, mutações nos genes ligados à resistência a medicamentos foram encontradas em muitas das amostras testadas. Isso sugeriu que os parasitas da malária na área se adaptaram pra resistir a certos tratamentos.

Algumas mutações foram comuns entre as amostras, enquanto outras variaram. Essa informação pode ajudar os profissionais de saúde pública a entender melhor a situação e potencialmente guiar estratégias de tratamento no futuro.

Através dos testes, também foi possível identificar casos onde pacientes tinham infecções mistas com diferentes cepas de parasitas. Isso é importante porque infecções mistas podem complicar o tratamento e contribuir pra disseminação da resistência a medicamentos.

Comparação com Outros Métodos

Ao comparar o Pf-SMARRT com as MIPs, os pesquisadores notaram que o Pf-SMARRT conseguiu identificar mais casos de tipos genéticos mistos em comparação com as MIPs. Isso significa que o Pf-SMARRT pode ser mais eficaz em detectar mutações de baixa frequência, o que é crucial pra monitorar a emergência de novos tipos de resistência.

No entanto, enquanto o Pf-SMARRT foi eficaz em diagnosticar infecções e identificar mutações, as MIPs tiveram um desempenho melhor em detectar grupos de parasitas intimamente relacionados, que é chave pra entender os padrões de transmissão em uma área específica.

Agrupando Amostras pra Análise Custo-Efetiva

Um experimento adicional envolveu agrupar amostras pra ver se essa estratégia poderia melhorar a detecção de mutações de uma forma custo-efetiva. Os pesquisadores combinaram amostras em grupos antes de sequenciá-las. Eles descobriram que o agrupamento poderia funcionar bem pra identificar mutações que ocorreram em frequências mais altas. No entanto, o método teve dificuldades com mutações raras, que muitas vezes passaram despercebidas nos grupos.

Os resultados indicaram que o agrupamento pode ser limitado ao monitoramento de mutações conhecidas em vez de novas. Pra aplicações práticas, é essencial equilibrar custo e sensibilidade ao monitorar a resistência a medicamentos nas populações de malária.

Implicações para a Saúde Pública

As descobertas desse estudo têm implicações significativas para os programas de controle da malária. À medida que os tratamentos para malária enfrentam desafios devido ao aumento da resistência, ferramentas como o Pf-SMARRT fornecem insights valiosos sobre a composição genética dos parasitas que afetam os pacientes. Ao melhorar nossa capacidade de rastrear resistência e variações na população de parasitas, os profissionais de saúde pública podem responder mais efetivamente às novas ameaças de resistência e adaptar as diretrizes de tratamento de acordo.

Entender como diferentes cepas se relacionam entre si também pode ajudar a direcionar intervenções de maneira mais eficaz. No geral, esses avanços apontam pra uma abordagem mais informada pra reduzir a carga da malária, especialmente em regiões onde a doença é prevalente.

Conclusão

O Pf-SMARRT representa um grande avanço na luta contra a malária. Sua capacidade de detectar eficazmente mutações relacionadas à resistência a medicamentos, enquanto também avalia a complexidade das infecções, oferece aos pesquisadores e profissionais de saúde pública uma ferramenta poderosa. À medida que mais sistemas de saúde têm acesso a essa tecnologia, o potencial de monitorar as populações de malária aumentará, contribuindo, em última análise, pra estratégias mais eficazes contra a transmissão de malária e resistência a medicamentos.

Resumindo, os métodos desenvolvidos nesse estudo têm o potencial de melhorar os esforços de controle da malária em Camarões e além. Ao fornecer uma abordagem acessível e eficiente pra entender a genética dos parasitas da malária, o Pf-SMARRT se destaca como um recurso vital na batalha contínua contra esse desafio de saúde global.

Fonte original

Título: Application of a new highly multiplexed amplicon sequencing tool to evaluate Plasmodium falciparum antimalarial resistance and relatedness in individual and pooled samples from Dschang, Cameroon

Resumo: BackgroundResistance to antimalarial drugs remains a major obstacle to malaria elimination. Multiplexed, targeted amplicon sequencing is being adopted for surveilling resistance and dissecting the genetics of complex malaria infections. Moreover, genotyping of parasites and detection of molecular markers drug resistance in resource-limited regions requires open-source protocols for processing samples, using accessible reagents, and rapid methods for processing numerous samples including pooled sequencing. MethodsPlasmodium falciparum Streamlined Multiplex Antimalarial Resistance and Relatedness Testing (Pf-SMARRT) is a PCR-based amplicon panel consisting of 15 amplicons targeting antimalarial resistance mutations and 9 amplicons targeting hypervariable regions. This assay uses oligonucleotide primers in two pools and a non-proprietary library and barcoding approach. ResultsWe evaluated Pf-SMARRT using control mocked dried blood spots (DBS) at varying levels of parasitemia and a mixture of 3D7 and Dd2 strains at known frequencies, showing the ability to genotype at low parasite density and recall within-sample allele frequencies. We then piloted Pf-SMARRT to genotype 100 parasite isolates collected from uncomplicated malaria cases at three health facilities in Dschang, Western Cameroon. Antimalarial resistance genotyping showed high levels of sulfadoxine-pyrimethamine resistance mutations, including 31% prevalence of the DHPS A613S mutation. No K13 candidate or validated artemisinin partial resistance mutations were detected, but one low-level non-synonymous change was observed. Pf-SMARRTs hypervariable targets, used to assess complexity of infections and parasite diversity and relatedness, showed similar levels and patterns compared to molecular inversion probe (MIP) sequencing. While there was strong concordance of antimalarial resistance mutations between individual samples and pools, low-frequency variants in the pooled samples were often missed. ConclusionOverall, Pf-SMARRT is a robust tool for assessing parasite relatedness and antimalarial drug resistance markers from both individual and pooled samples. Control samples support that accurate genotyping as low as 1 parasite per microliter is routinely possible. SCOPE STATEMENT (200)Malaria remains a critical global public health problem. Antimalarial drug resistance has repeatedly undermined control and the emergence of artemisinin partial resistance in Africa is the latest major challenge. Malaria molecular surveillance (MMS) has emerged as a powerful tool to monitor molecular markers of resistance and changes in the parasite population. Streamlined methods are needed that can be readily adopted in endemic countries. We developed Plasmodium falciparum Streamlined Multiplex Antimalarial Resistance and Relatedness Testing (Pf-SMARRT), a multiplex amplicon deep sequencing approach that uses easily accessible products without proprietary steps and can be sequenced on any Illumina sequencer. We validated this tool using controls, including mocked dried blood spots, and then implemented it to evaluate resistance and parasite relatedness among 100 samples from Cameroon. The assay was able to reliably assess the within-sample allele frequency of antimalarial resistance markers and discriminate strains within and between individuals. We also evaluated a more cost-effective surveillance approach for antimalarial resistance polymorphisms using pooled samples. While within-pool frequencies of mutations were accurate in pools with higher numbers of samples, this resulted in the loss of the ability to detect variants uncommon in the pool. Overall Pf-SMARRT provides a new protocol for conducting MMS that is easily implementable in Africa.

Autores: Jonathan J Juliano, J. M. Sadler, A. Simkin, V. P. K. Tchuenkam, I. Gerdes Gyuricza, A. Fola, K. Wamae, A. Assefa, K. Niare, K. Thwai, S. J. White, W. Moss, R. Dinglasan, S. Nsango, C. B. Tume, J. B. Parr, I. M. Ali, J. A. Bailey

Última atualização: 2024-10-10 00:00:00

Idioma: English

Fonte URL: https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2024.10.03.24314715

Fonte PDF: https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2024.10.03.24314715.full.pdf

Licença: https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Alterações: Este resumo foi elaborado com a assistência da AI e pode conter imprecisões. Para obter informações exactas, consulte os documentos originais ligados aqui.

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