Fermento: O Segredo Pequeno por Trás da Grande Ciência
Descubra como o fermento ajuda na pesquisa de proteínas e no transporte de aminoácidos.
Unnati Sonawala, Aymeric Busidan, David Haak, Guillaume Pilot
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Índice
- A Importância dos Aminoácidos
- Complementação Funcional em Fermento
- Cepas de Fermento e Seus Transportadores
- Mutantes de Fermento Mais Complexos
- Testando a Absorção de Aminoácidos
- Identificando Mudanças Genéticas no Fermento
- Confusão de Tipo de Cruzamento
- Desempenho de Crescimento dos Mutantes
- Conclusão: O Fermento como um Herói da Pesquisa
- Fonte original
O fermento, um mini fungo que você pode ter visto no seu pão ou cerveja, é mais do que só um ajudante na cozinha. Ele desempenha um papel crucial no estudo dos seres vivos, especialmente quando se trata de entender proteínas em organismos superiores, como plantas e animais. Os cientistas costumam usar o fermento simples, tipo o fermento de padeiro, para mergulhar na biologia celular e nas vias metabólicas. Isso porque os processos básicos que rolam no fermento são bem parecidos com os de organismos mais complexos. Pense no fermento como o agente secreto do laboratório, facilitando a compreensão da biologia complicada.
Aminoácidos
A Importância dosAminoácidos são as peças-chave da vida. Eles fazem um monte de trabalho duro nas células, como produzir proteínas e equilibrar os níveis de nitrogênio, que são essenciais para o crescimento. Os aminoácidos também ajudam a fazer nucleosídeos, que são cruciais para o DNA. Para mover esses aminoácidos para dentro e para fora das células, temos os Transportadores de aminoácidos. Esses transportadores são como caminhões de entrega, garantindo que cada aminoácido chegue aonde precisa.
Os transportadores podem ser complicados de estudar, mas usar fermento torna tudo mais fácil. Ao inserir genes de outros organismos no fermento, os cientistas podem ver como o fermento absorve diferentes aminoácidos. Se o fermento consegue crescer bem com certos aminoácidos, significa que os transportadores estão fazendo seu trabalho.
Complementação Funcional em Fermento
Complementação funcional é um termo chique para uma ideia simples: se você pegar uma cepa de fermento que não consegue fazer algo e der a ela um gene que pode ajudar, ela deve começar a funcionar de novo. Por exemplo, se você tem uma cepa de fermento que não consegue transportar histidina porque está faltando o gene certo, você pode introduzir um gene de uma planta que faz esse trabalho. Se o fermento começa a crescer de novo, é um sinal de que o gene está funcionando.
Nos anos 1990, os cientistas começaram a usar essa técnica para estudar transportadores de aminoácidos de plantas, o que levou à descoberta de vários transportadores. Isso foi emocionante! Eles podiam identificar como esses transportadores funcionavam ao ver se o fermento conseguia absorver os aminoácidos que estavam faltando depois de adicionar os genes certos.
Cepas de Fermento e Seus Transportadores
O fermento tem cerca de 22 diferentes proteínas transportadoras de aminoácidos localizadas em sua membrana. Elas são agrupadas em famílias com base em suas características. Alguns transportadores são como generalistas, ou seja, conseguem lidar com uma variedade de aminoácidos, enquanto outros são mais especializados. Por exemplo, existem transportadores que se concentram apenas em certos aminoácidos, tornando-os um pouco exigentes.
O estudo dos transportadores de aminoácidos começou a sério quando pesquisadores usaram cepas específicas de fermento que estavam faltando certos transportadores. Por exemplo, uma cepa de fermento chamada JT16 foi utilizada para identificar transportadores de aminoácidos de plantas. Quando os pesquisadores desativaram genes específicos no fermento, eles podiam procurar por transportadores de plantas que poderiam "salvar" a capacidade do fermento de crescer.
Mutantes de Fermento Mais Complexos
Construindo sobre esse sucesso, os cientistas começaram a criar cepas de fermento ainda mais complexas. Eles deletariam vários genes de transportadores do fermento, tornando-o incapaz de usar vários aminoácidos para crescer. Assim, poderiam introduzir novos transportadores de plantas ou outros organismos e ver se o fermento conseguiria crescer de novo.
Uma dessas cepas, chamada 22Δ8AA, foi projetada para ser deficiente em vários transportadores de aminoácidos. Os pesquisadores então criaram a cepa 22Δ10α ao desativar ainda mais genes. O objetivo era fazer uma cepa de fermento que fosse mais simples de estudar, porque teria menos transportadores atrapalhando.
À medida que esse fermento passava por mais mudanças genéticas, os cientistas acompanhavam cuidadosamente os resultados. Eles anotavam quais genes foram deletados e como essas mudanças afetavam a capacidade da cepa de crescer em diferentes aminoácidos.
Testando a Absorção de Aminoácidos
Para ver como essas cepas de fermento absorviam aminoácidos, os pesquisadores faziam ensaios de absorção. Isso é basicamente um nome chique para medir quanto de um aminoácido específico o fermento absorve. Eles usavam aminoácidos radiolabelados, que são aminoácidos com marcadores radioativos para que os pesquisadores pudessem rastreá-los.
O processo envolve dar ao fermento uma chance de absorver esses aminoácidos, geralmente por um curto período. Depois, eles medem a radioatividade para ver quanto o fermento absorveu.
As descobertas desses experimentos às vezes eram surpreendentes. Por exemplo, mesmo quando uma cepa de fermento não conseguia crescer em um aminoácido, ainda conseguia absorver uma parte dele. Essa peculiaridade levantou questões sobre a relação entre crescimento e absorção de aminoácidos.
Identificando Mudanças Genéticas no Fermento
À medida que os cientistas trabalhavam com essas cepas de fermento aprimoradas, eles queriam ter certeza de que nenhuma mudança inesperada estava rolando no DNA do fermento. Eles sequenciaram o genoma da cepa 22Δ10α para procurar qualquer mudança.
Esse passo era necessário porque quando você deleta genes, às vezes o DNA do fermento pode ter suas próprias surpresas, como rearranjos ou mutações. Métodos de alta tecnologia foram usados para analisar as mudanças genéticas do fermento, garantindo que tudo coincidisse com os resultados esperados.
Confusão de Tipo de Cruzamento
No processo de estudar essas cepas, os cientistas descobriram uma reviravolta engraçada: o tipo de cruzamento da cepa 22Δ10α era diferente do que se pensava anteriormente. Em vez de ser rotulada como MATα, na verdade era MATa. Isso é tipo chamar um gato de cachorro-não rola! A confusão sobre o tipo de cruzamento estava por aí há um tempo, mas os testes recentes esclareceram a situação.
Desempenho de Crescimento dos Mutantes
Enquanto os cientistas continuavam a ajustar e testar suas cepas de fermento, perceberam que algumas tinham taxas de crescimento mais lentas do que suas cepas-mãe. Esse crescimento mais lento era um desafio, especialmente em ambientes ricos em nutrientes. Eles precisavam garantir que todas as cepas sendo estudadas ainda pudessem funcionar de forma eficaz para sua pesquisa sobre transporte de aminoácidos.
Os pesquisadores realizaram experimentos cuidadosos para medir quão rapidamente as células de fermento dobravam de tamanho. Eles descobriram que as novas cepas desenvolvidas cresciam mais lentamente do que o esperado, o que poderia afetar a confiabilidade de seus resultados.
Conclusão: O Fermento como um Herói da Pesquisa
Resumindo, o fermento é mais do que só um parceiro de assar; é uma ferramenta de pesquisa incrível que oferece insights sobre como as células funcionam. Manipulando o fermento e estudando como ele lida com os aminoácidos, os cientistas podem descobrir como as proteínas funcionam e como os organismos vivos crescem.
Essa pesquisa nos ajuda a apreciar os intricados mecanismos da vida. Então, na próxima vez que você saborear uma fatia de pão ou um gole de cerveja, lembre-se de que tem muita ciência por trás dessas criações deliciosas, graças aos nossos pequenos amigos do mundo do fermento!
Título: Characterization and whole genome sequencing of Saccharomyces cerevisiae strains lacking several amino acid transporters: tools for studying amino acid transport
Resumo: Saccharomyces cerevisiae mutants have been used since the early 1980s as a tool to characterize genes from other organisms by functional complementation. This approach has been extremely successful in cloning and studying transporters, for instance, plant amino acid, sugar, urea, ammonium, peptide, sodium, and potassium were characterized using yeast mutants lacking these functions. Over the years, new strains lacking even more endogenous transporters have been developed, enabling the characterization of transport properties of heterologous proteins in a more precise way. Furthermore, these strains provide the added advantage of characterization of a transporter belonging to a family of proteins in isolation, and thus can be used to study the relative contribution of redundant transporters to the whole function. We focused on amino acid transport; starting with the yeast strain 22{Delta}8AA, developed to clone plant amino acid transporters in the early 2000s. We recently deleted two additional amino acid permeases, Gnp1 and Agp1, creating 22{Delta}10. In the present work, five additional permeases (Bap3, Tat1, Tat2, Agp3, Bap2) were deleted from 22{Delta}10 genome in up to a combination of three at a time. Unexpectedly, the amino acid transport properties of the new strains were not very different from the parent, suggesting that these amino acid permeases play a minor role in amino acid uptake in our conditions. The inability to grow on a few amino acids as the sole nitrogen sources did not correlate with lower uptake activity, questioning the well-accepted relationship between lack of growth and loss of transport properties. Finally, in order to verify the mutations and the integrity of 22{Delta}10 genome, we performed whole-genome sequencing of 22{Delta}10 using long-read PacBio sequencing technology. We successfully assembled 22{Delta}10s genome de novo, identified all expected mutations and precisely characterized the nature of the deletions of the ten amino acid transporters. The sequencing data and genome will serve as a resource to researchers interested in using these strains as a tool for amino acid transport study.
Autores: Unnati Sonawala, Aymeric Busidan, David Haak, Guillaume Pilot
Última atualização: 2024-12-05 00:00:00
Idioma: English
Fonte URL: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.12.03.626691
Fonte PDF: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.12.03.626691.full.pdf
Licença: https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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