Avanços nas Técnicas de Microscopia Correlativa

A microscopia de luz e eletrônica correlativa (CLEM) é um jeito de olhar de perto células e suas partes, misturando dois tipos de imagem: microscopia de luz e Microscopia Eletrônica. Cada tipo tem suas vantagens e desvantagens. A microscopia de luz é ótima para observar células vivas e ver seu comportamento, enquanto a microscopia eletrônica mostra imagens bem detalhadas da estrutura celular. Usando os dois métodos juntos, o CLEM permite que os pesquisadores estudem eventos raros na biologia com alto nível de detalhe e contexto.

#Como Funciona a Microscopia de Luz

A microscopia de luz usa luz para iluminar amostras, permitindo que os cientistas vejam estruturas em nível celular. Os pesquisadores costumam marcar moléculas importantes em células vivas com proteínas coloridas especiais que brilham quando atingidas por uma luz específica. Esse brilho ajuda a ver como essas moléculas interagem enquanto as células realizam diferentes atividades. Porém, por causa do jeito que a luz se comporta, a microscopia de luz só consegue resolver detalhes que estão a cerca de 200 nanômetros de distância. Isso quer dizer que, enquanto conseguem ver estruturas grandes, geralmente perdem detalhes menores e mais finos dentro das células.

#Limitações da Microscopia de Luz

Embora existam métodos que podem melhorar a resolução da microscopia de luz, eles costumam precisar de equipamentos especiais e uma preparação cuidadosa das amostras, o que pode limitar seu uso. Além disso, a microscopia de luz geralmente foca em moléculas específicas, muitas vezes não mostrando as estruturas ao redor dentro das células. Isso pode dificultar a compreensão de como essas moléculas se encaixam no quadro maior da organização celular.

#Vantagens da Microscopia Eletrônica

A microscopia eletrônica supera muitas limitações da microscopia de luz. Ela alcança uma resolução muito maior, permitindo que os pesquisadores vejam detalhes intrincados da estrutura celular. No entanto, a microscopia eletrônica geralmente tem um campo de visão menor, o que significa que, enquanto mostra muitos detalhes em uma área pequena, pode não captar um contexto maior tão eficazmente.

#O Que o CLEM Oferece

O CLEM combina microscopia de luz e eletrônica, aproveitando as forças de ambos os métodos enquanto contorna suas fraquezas. Essa abordagem levou a descobertas significativas na biologia, como a estrutura de túneis em neurônios, a fusão de vasos sanguíneos em zebrafish e a localização de bactérias de tuberculose em células humanas.

#Passos no CLEM

Um jeito comum de fazer CLEM envolve duas etapas principais: primeiro, tirar imagens com microscopia de luz e, depois, com microscopia eletrônica.

1. Preparação da Amostra: Isso envolve marcar as estruturas de interesse com corantes ou proteínas fluorescentes, permitindo que os pesquisadores criem um conjunto de imagens da amostra.
2. Imagem com Microscopia de Luz: Os pesquisadores adquirem uma série de imagens, que mostram como as estruturas marcadas se comportam em tempo real.
3. Preparação para a Microscopia Eletrônica: A amostra é tratada para preservar sua estrutura, manchada com metais pesados para criar contraste, e depois embutida em resina.
4. Imagem com Microscopia Eletrônica: Fatias finas da amostra são cortadas para captar imagens detalhadas, resultando em uma série de imagens que fornecem uma visão de alta resolução das estruturas.

Após a imagem, existem dois conjuntos de pilhas de imagens: uma da microscopia de luz e outra da microscopia eletrônica. O desafio agora é alinhar esses dois conjuntos de imagens para que os dados de ambos os métodos se encaixem, permitindo a análise adequada.

#Alinhando as Imagens

Alinhar os dois conjuntos de imagens pode ser complicado devido a diferenças na resolução, contraste e na maneira como as imagens foram capturadas. Para entender os dois conjuntos de dados, os pesquisadores precisam encontrar um jeito de alinhá-los com precisão. Existem duas maneiras principais para isso:

1. Processando as Imagens: Uma maneira é ajustar uma ou ambas as imagens para que pareçam semelhantes. Uma vez que elas aparecem parecidas, métodos tradicionais usados em imagens médicas podem ser aplicados para alinhá-las automaticamente.
2. Usando Marcas: O segundo método envolve selecionar características específicas que podem ser vistas em ambas as técnicas de imagem. Ao identificar e marcar essas características em ambos os conjuntos de dados, os pesquisadores podem calcular como transformar um conjunto de imagens para alinhar com o outro.

#Desafios no Alinhamento

Ambos os métodos de alinhamento de imagens têm seus desafios. O primeiro método, que envolve processar imagens para torná-las mais parecidas, pode ser eficaz, mas requer muito trabalho preliminar. O segundo método usando marcas é manual e pode ser tedioso, levando muito tempo, e pode introduzir viés, já que as características escolhidas para o alinhamento podem ser semelhantes àquelas que estão sendo estudadas. Por isso, encontrar jeitos de automatizar a identificação de marcas é bastante desejável.

#Novo Fluxo de Trabalho para CLEM

Para lidar com os problemas mencionados, um novo fluxo de trabalho foi desenvolvido para segmentar mitocôndrias, que são abundantes e comuns nas células. Esse passo ajuda a encontrar estruturas correspondentes entre imagens de microscopia de luz e eletrônica. Diferentes métodos podem ser usados para segmentar as imagens, variando de processamento de imagem tradicional a técnicas avançadas de aprendizado de máquina.

Depois de segmentar as mitocôndrias, pontos são amostrados dessas segmentações para criar uma "nuvem de pontos" para cada modalidade de imagem. Nuvens de Pontos são uma maneira de representar os dados que reduz a quantidade de informação que precisa ser processada, melhorando a eficiência.

#Registro das Nuvens de Pontos

Uma vez que as nuvens de pontos são criadas, elas podem ser alinhadas usando técnicas modernas. Um método chamado Coherent Point Drift (CPD) permite que a tarefa de alinhamento seja tratada como um problema de probabilidade, o que significa que a correspondência estrita ponto a ponto não é necessária.

Todo o processo roda como um plugin para um visualizador de imagens chamado napari. Este plugin oferece uma maneira simples para os usuários realizarem o alinhamento com o toque de um botão ou fazer ajustes em etapas específicas do fluxo de trabalho, se necessário.

#Testando o Novo Método

Para ver como esse novo método funciona, conjuntos de dados de células HeLa foram utilizados. Esses conjuntos de dados permitem comparações com alinhamentos manuais de especialistas para avaliar o desempenho do novo método.

Para as avaliações, estruturas-chave não usadas no registro foram identificadas, e a sobreposição entre as estruturas segmentadas das duas modalidades foi medida. Uma métrica chamada taxa de verdade positiva (TPR) foi usada para quantificar quão bem as duas imagens se alinham. Os resultados mostraram que o método automatizado alcançou um alinhamento que estava próximo do desempenho em nível de especialista.

#Acessibilidade e Amigabilidade do Usuário

O plugin napari torna esse novo método acessível a uma gama mais ampla de usuários, incluindo aqueles que podem não ser especialistas em microscopia. A interface permite operações rápidas, mas também oferece opções para visualizar e ajustar estágios intermediários do processo.

Os usuários podem facilmente ajustar parâmetros e ver como as mudanças afetam o resultado, ou até usar suas próprias segmentações de diferentes fontes, adicionando flexibilidade ao fluxo de trabalho.

#Perspectivas Futuras

Embora o novo fluxo de trabalho CLEM mostre grande potencial, ainda há desafios a serem superados. Um deles é a necessidade de melhores métodos automatizados para Segmentação de organelas na microscopia eletrônica. Métodos e ferramentas que facilitam o treinamento de modelos de aprendizado profundo estão surgindo, permitindo que os pesquisadores melhorem o desempenho sem precisar de conjuntos de dados extensos desde o início.

Outro desafio é o tamanho dos conjuntos de dados de bioimagem. À medida que esses conjuntos de dados crescem, métodos para lidar com dados maiores sem enfrentar problemas de memória do computador serão essenciais.

Otimizar o fluxo de trabalho para tempos de processamento mais rápidos, especialmente incluindo aceleração por GPU, também é um objetivo futuro.

#Conclusão

O CLEM é uma técnica poderosa que junta a microscopia de luz e eletrônica para obter uma visão abrangente das estruturas e processos biológicos. O novo fluxo de trabalho automatizado de CLEM, impulsionado por métodos avançados de segmentação e nuvem de pontos, abre possibilidades para pesquisas extensivas em muitos campos biológicos. Ao tornar esse método acessível a diversos usuários por meio de um software amigável, ele tem o potencial de aumentar nossa compreensão de sistemas biológicos complexos.

No fim, com os desenvolvimentos contínuos em técnicas de imagem, processamento e aprendizado de máquina, o CLEM continuará a evoluir, fornecendo insights mais profundos sobre o fascinante mundo das células e seus componentes.