Impatto dei metodi di preparazione dei liposomi sulla perdita di lipidi

I liposomi sono piccole bolle fatte di lipidi, che sono i grassi che formano le membrane delle nostre cellule. Vengono utilizzati in molti studi scientifici per simulare le membrane cellulari. Ci sono tre tipi principali di liposomi basati sulla loro dimensione: vesicole unilamellari piccole (SUV), vesicole unilamellari grandi (LUV) e vesicole unilamellari giganti (GUV). Questo articolo si concentrerà su SUV e LUV.

#Come si fanno i liposomi

Ci sono vari modi per preparare SUV e LUV. Un approccio comune consiste nel mescolare lipidi in un solvente organico, asciugarli in un film sottile e poi ri-sospendere questo film in acqua o in un tampone. Dopo questo, si usano diverse tecniche per formare i liposomi:

1. Estrazione: Qui si spinge il mix di lipidi attraverso un filtro con fori piccolissimi per creare liposomi di dimensioni specifiche.
2. Congelamento-scongelamento: Il mix di lipidi viene congelato e poi scongelato più volte, il che aiuta a formare liposomi.
3. Sonificazione: Si usano onde sonore ad alta frequenza per rompere il mix di lipidi in liposomi più piccoli.

Ogni metodo ha i suoi pro e contro. Ad esempio, l'estrazione può produrre dimensioni di liposoma più uniformi, mentre la sonificazione è più veloce ma potrebbe portare a dimensioni variabili.

#Problemi nella preparazione dei liposomi

Quando si fanno i liposomi, può essere complicato garantire che siano stati usati gli giusti quantità di lipidi. Spesso, i ricercatori presuppongono di non aver perso lipidi durante la preparazione. Tuttavia, studi suggeriscono che il contenuto lipidico può variare, sia all'interno di un lotto che tra diversi lotti. Ad esempio, quanto colesterolo è incluso può influenzare il prodotto finale.

#Lo studio

Il nostro studio mira a determinare quanto lipid loss avviene durante la formazione di liposomi e quanto è consistente la loro composizione. Ci siamo concentrati su un mix di lipidi comune composto da due componenti: fosfatidilcolina oleoyl palmitoleica (POPC) e colesterolo.

#Metodi per esaminare i liposomi

Abbiamo creato liposomi dal nostro mix di lipidi e abbiamo utilizzato la cromatografia liquida ad alte prestazioni con rilevamento a scattering di luce evaporativa (HPLC-ELSD) per misurare la composizione lipidica e il recupero. Questo metodo ci consente di identificare i lipidi basandoci sulle loro proprietà note e di quantificarli accuratamente.

#Preparazione dei campioni

Per preparare i nostri campioni di liposomi, abbiamo prima mescolato le nostre soluzioni lipidiche e poi le abbiamo asciugate per formare un film sottile. Abbiamo poi ri-sospeso questo film in acqua e usato diversi metodi (estrazione, congelamento-scongelamento e sonificazione) per preparare i liposomi. Dopo ogni fase, abbiamo preso campioni per analizzare quali lipidi erano rimasti.

#Analisi del recupero lipidico

Utilizzando HPLC-ELSD, abbiamo scoperto che una quantità significativa di lipidi può andare persa durante la preparazione. In alcuni casi, quasi metà dei lipidi è andata persa. La maggior parte di questa perdita ha avuto luogo durante la fase di ri-sospensione, anche quando è stato utilizzato un mescolamento vigoroso.

#L'effetto delle diverse tecniche

Nei nostri esperimenti, abbiamo scoperto che il metodo di ri-sospensione influisce notevolmente sul recupero lipidico. Utilizzando diversi tipi di miscelatori a vortice, abbiamo visto che alcuni erano significativamente migliori nel recuperare lipidi rispetto ad altri. Abbiamo quindi esaminato quanto e quanto velocemente mescolare i lipidi per massimizzare il recupero.

#Risultati sulla perdita di lipidi

Dai nostri risultati, abbiamo appreso che:

• La ri-sospensione è critica e può portare a una notevole perdita di lipidi, specialmente se fatta in modo errato.
• I diversi miscelatori a vortice possono dare risultati variabili nel recupero lipidico.
• Tempi di miscelazione più lunghi generalmente migliorano i tassi di recupero lipidico.

#Il ruolo del tempo di idratazione

Abbiamo anche testato quanto tempo idratare il film lipidico prima di mescolare. Abbiamo scoperto che variare il tempo di idratazione aveva poco effetto sul recupero lipidico. Questo significa che il tempo speso a far "inzuppare" il film lipidico non era così importante per i nostri risultati.

#Processo di estrazione

Il processo di estrazione in sé ha causato una minima perdita di lipidi. Anche se alcuni lipidi sono stati persi, non è stata così significativa come le perdite viste durante la ri-sospensione.

#Confronto dei metodi di sintesi dei liposomi

Abbiamo condotto esperimenti per confrontare l'efficacia dei tre metodi di preparazione dei liposomi. I nostri risultati hanno indicato:

• Sonificazione è stata la più efficace nel recuperare lipidi, raggiungendo spesso quasi un recupero completo.
• Congelamento-scongelamento ha prodotto risultati migliori rispetto all'estrazione standard, ma era meno efficace della sonificazione.
• Estrazione standard ha avuto la perdita di lipidi più alta rispetto agli altri due metodi.

#Distribuzione delle dimensioni dei liposomi

Per valutare la distribuzione delle dimensioni dei liposomi prodotti da ogni metodo, abbiamo usato una tecnica chiamata scattering di luce dinamico (DLS). Questo ha mostrato che i metodi di estrazione producevano liposomi di dimensioni simili, mentre la sonificazione risultava in un'ampia gamma di dimensioni.

#Effetti della concentrazione di colesterolo

Abbiamo esplorato come diverse proporzioni di colesterolo rispetto a POPC influenzano il recupero lipidico e la composizione. Usando diverse miscele, abbiamo scoperto che:

• Concentrati di colesterolo più alti a volte portavano a un recupero lipidico minore.
• La composizione complessiva dei lipidi rimaneva coerente tra diverse proporzioni.

#Migliori pratiche per la preparazione dei liposomi

In base ai nostri risultati, suggeriamo alcune migliori pratiche per preparare liposomi:

1. Usare un mescolamento vigoroso e prolungato (almeno 30 secondi) durante la ri-sospensione per massimizzare il recupero lipidico.
2. Considerare di utilizzare cicli di congelamento-scongelamento, specialmente se il passo di ri-sospensione non porta a un recupero completo.
3. La sonificazione può anche migliorare i rendimenti lipidici.
4. Accettare che alcune piccole perdite sono tipiche durante il passo di estrazione e pianificare di conseguenza.
5. Validare il proprio metodo di preparazione per assicurare l'affidabilità.

#Conclusione

Il nostro studio evidenzia gli impatti di vari metodi di preparazione sulla perdita di lipidi e sulla composizione per la formazione di liposomi. Il passo di ri-sospensione è particolarmente cruciale e può portare a perdite significative di lipidi se non fatto correttamente. Seguendo le migliori pratiche identificate in questo lavoro, i ricercatori possono ottenere risultati migliori nelle loro preparazioni lipidiche per varie applicazioni.

In generale, è essenziale per i ricercatori verificare il recupero lipidico e la composizione nelle proprie preparazioni di liposomi, poiché le variazioni possono avere un impatto significativo sui risultati sperimentali.