Capire l'impatto dell'HIV sulle cellule infette

Non sappiamo esattamente perché alcune persone con l'HIV abbiano quantità diverse di virus nel sangue. Abbiamo esaminato se avere alte quantità di virus nel sangue sia collegato ad avere molte cellule infette che mostrano segni del virus. Abbiamo scoperto che la quantità di virus nel sangue non era collegata al numero di cellule infette che mostrano il virus; piuttosto, era solo correlata al numero totale di cellule infette. Questi risultati aiutano a chiarire come l'HIV influisce sul corpo, suggerendo che il controllo avviene dopo che il virus inizia a fare le sue copie.

#Introduzione

L'HIV infetta principalmente un tipo di cellula immunitaria chiamata cellule T CD4+. Il virus si attacca a un recettore su queste cellule e ci entra. Una volta dentro, rilascia il suo nucleo, che si sposta poi nel nucleo della cellula ospite dove copia se stesso. Dopo questo, le informazioni genetiche del virus vengono inserite nel DNA dell'ospite per creare un provirus. La cellula usa poi la sua macchina per fare copie del materiale genetico del virus, che si presentano in due forme: RNA spliced e unspliced. L'RNA unspliced viene impacchettato in nuove particelle virali, che possono poi infettare altre cellule. Il livello costante di virus nel sangue dipende da quanti cellule sono infette e da quante particelle virali vengono prodotte in ogni ciclo di infezione. Questo livello è un indicatore importante di come la malattia progredisce verso l'AIDS e può portare alla morte.

In persone con HIV non trattato, la quantità di virus nel sangue può variare ampiamente, da molto bassa a estremamente alta. Studi mostrano che quelli con bassi livelli di virus (chiamati controllori virali) di solito hanno molte meno cellule infette rispetto a quelli con alti livelli di virus (non controllori). Questo ci porta a chiederci se i controllori virali abbiano anche meno cellule che mostrano segni del virus. Volevamo scoprire come la quantità di virus nel sangue sia correlata al numero di cellule infette che mostrano RNA unspliced.

#Partecipanti e Caratteristiche del Campione

Per indagare il legame tra i livelli di virus e le cellule infette con RNA unspliced, abbiamo studiato campioni di sangue di otto donatori non trattati con bassi livelli di virus e sette con alti livelli di virus. I campioni di sangue sono stati prelevati direttamente per evitare di perdere cellule durante l'elaborazione. La maggior parte delle cellule infette nel sangue sono cellule T CD4+, quindi l'RNA unspliced che abbiamo rilevato proveniva principalmente da queste cellule.

Il gruppo a bassa viremia aveva un livello di virus basso ma rilevabile, mentre il gruppo ad alta viremia aveva un livello di virus molto alto. I partecipanti erano per lo più maschi, e le loro etnie includevano nero, bianco e multirazziale. Vivevano con l'HIV da una media di circa nove anni. Alcuni erano nuove infezioni, mentre altri avevano interruzioni del trattamento.

#Caratterizzazione Virologica dei Controllori e Non-Controllori Virali

Prima di confrontare i numeri delle cellule infette, abbiamo prima misurato i livelli di virus in entrambi i gruppi e stimato il numero di cellule infette controllando il DNA dell'HIV nel sangue. Abbiamo scoperto che i livelli di virus plasmatico erano significativamente più bassi nel gruppo a bassa viremia rispetto a quello ad alta viremia. Allo stesso modo, il numero di cellule infette era anch'esso molto più basso nel gruppo a basso virus. Non c'era collegamento tra il numero di cellule infette e quanto tempo i partecipanti erano stati infettati. Tuttavia, abbiamo notato alcune tendenze riguardo alla salute delle loro cellule immunitarie.

Abbiamo scoperto un forte legame tra la quantità di virus nel sangue e il numero di cellule infette, ma questa scoperta non spiega quanto siano attive queste cellule infette nella produzione di nuove particelle virali.

#Il Numero Totale di Cellule Infette con RNA Unspliced

Abbiamo esaminato se il numero totale di cellule del sangue con RNA unspliced fosse correlato ai livelli di virus usando un metodo specifico progettato per analizzare singole cellule infette. Questo approccio ci ha permesso di valutare la quantità totale di RNA unspliced presente nel sangue di ogni partecipante.

I nostri risultati hanno mostrato che il numero totale di cellule infette con RNA unspliced era significativamente più basso nel gruppo a basso virus rispetto al gruppo ad alto virus. Abbiamo anche trovato una forte relazione positiva tra i livelli di virus nel sangue e il numero di cellule con RNA unspliced. Inoltre, c'era una correlazione diretta tra il numero totale di cellule infette e quelle contenenti RNA unspliced.

Abbiamo esaminato più a fondo la frequenza delle cellule che avevano alti livelli di RNA unspliced. Abbiamo definito queste cellule come quelle con più di dieci copie di RNA unspliced. Ancora una volta, abbiamo trovato significativamente meno di queste cellule “ad alta espressione” nel gruppo a basso virus. Abbiamo osservato una chiara connessione tra il numero di cellule ad alta espressione e i livelli di virus nel sangue.

#La Fraczione di Cellule Infette con RNA Unspliced

Successivamente, volevamo misurare la frazione di cellule sanguigne infette che avevano RNA unspliced in entrambi i gruppi. Se il gruppo a basso virus avesse avuto un blocco migliore sull'attività del virus, ci aspetteremmo che mostrassero una frazione più piccola di cellule infette con RNA unspliced rispetto al gruppo ad alto virus. La nostra analisi ha mostrato che solo una piccola frazione di cellule infette conteneva RNA unspliced in entrambi i gruppi, e questa frazione non era significativamente diversa.

È importante notare che questi risultati indicano che i livelli di virus nel sangue non sono correlati alla percentuale di cellule sanguigne infette che esprimono RNA unspliced. Suggerisce anche che la maggior parte delle cellule infette non sta producendo virus al momento in cui abbiamo preso i campioni.

#I Livelli di RNA Unspliced nelle Singole Cellule Infette

Abbiamo anche analizzato la quantità di RNA unspliced nelle singole cellule infette. Abbiamo trovato che il numero medio di copie di RNA unspliced per cellula infetta non era significativamente diverso tra i due gruppi. Anche se non abbiamo visto grandi differenze tra i gruppi a basso e alto virus in termini di livelli di RNA unspliced nella maggior parte delle cellule, abbiamo notato una leggera tendenza affinché le cellule “ad alta espressione” avessero meno copie di RNA unspliced nel gruppo a basso virus rispetto a quello ad alto virus.

#Analisi Filogenetica dell'RNA Unspliced dell'HIV

Per vedere la varietà genetica dell'RNA unspliced dell'HIV in entrambi i gruppi, abbiamo sequenziato e analizzato il virus trovato nel sangue e nelle cellule infette. Volevamo determinare se la varietà del virus differisse tra i due gruppi. I nostri risultati hanno rivelato che la diversità genetica dell'HIV non era significativamente diversa tra i due gruppi. Abbiamo notato che sia il gruppo a basso virus che quello ad alto virus avevano popolazioni diverse di provirus attivi nella produzione di RNA unspliced.

#Conclusioni

La nostra ricerca si è concentrata su se ci sia una differenza nell'attività dei provirus tra individui con bassi e alti livelli di virus. Abbiamo trovato che meno del dieci percento dei provirus esprime RNA unspliced in entrambi i gruppi, indipendentemente dai livelli di virus nel sangue. Il controllo del virus negli individui con livelli più bassi sembra derivare dall'avere meno cellule infette piuttosto che da una differenza in quanto attivi siano i provirus.

Questi risultati suggeriscono che i meccanismi dietro il controllo dell'HIV potrebbero differire da quelli nei controllori d'élite, dove è stato suggerito che ci sia un blocco dell'espressione provirale potenziato. I nostri risultati indicano che il focus per ottenere un miglior controllo dell'HIV dovrebbe essere sull'eliminazione delle cellule infette, anche se migliorare il silenziamento dell'espressione provirale potrebbe anche aiutare a raggiungere una remissione a lungo termine.

#Materiali e Metodi

#Coorte dei Partecipanti e Raccolta dei Campioni

I campioni di sangue sono stati prelevati da individui con HIV che non stavano ricevendo ART. I partecipanti sono stati arruolati come parte di esperimenti approvati dai relativi comitati etici. Tutti i donatori hanno dato il consenso scritto per la ricerca. Abbiamo raccolto sangue in un momento in cui il virus si era stabilizzato a un livello costante.

#Livelli di DNA dell'HIV

Per stimare il numero di cellule infette, abbiamo misurato i livelli di DNA dell'HIV nel sangue. Abbiamo usato un saggio specializzato per valutare accuratamente il numero di cellule infette.

#Panoramica dell'Assay di Sequenziamento a Genoma Singolo Associato alle Cellule di RNA e DNA (CARD-SGS)

Il metodo CARD-SGS è stato adattato per migliorare la capacità di rilevare RNA dell'HIV da piccole quantità di cellule infette. Questo metodo prevede l'estrazione di acido nucleico totale e la preparazione per un'analisi dettagliata, consentendoci di esplorare l'RNA dell'HIV in cellule singole, assicurandoci che l'estrazione di altri componenti non ostacoli i nostri risultati.

#Metodo CARD-SGS Dettagliato

Abbiamo seguito una serie di passaggi per preparare i campioni e estrarre RNA, portando all'amplificazione a genoma singolo delle molecole di RNA dell'HIV. Ogni passaggio è stato progettato per garantire alta sensibilità e accuratezza nella misurazione dell'attività dell'HIV nelle singole cellule infette.

#Disponibilità dei Dati di Sequenza

Tutti i dati raccolti durante questo studio sono disponibili per la revisione.

#Analisi Statistiche

Abbiamo effettuato diverse analisi statistiche per capire le relazioni tra le diverse variabili nel nostro studio. Ogni metodo è stato scelto in base alla natura dei dati e alle relazioni che volevamo analizzare.