Nanotiming: Un Metodo Economico per Mappare il Momento della Replica del DNA

I cromosomi delle cellule eucariotiche si duplicano in un ordine specifico. Questo ordine, conosciuto come timing di replicazione (RT), è importante per mantenere la struttura della cromatina, che è il materiale che compone i cromosomi. Il RT è collegato a come i geni sono organizzati nello spazio e a quanto sono attivi durante il processo di duplicazione.

I metodi attuali per monitorare il RT generalmente osservano i cambiamenti nel numero di copie di DNA o l'uso di nucleotidi speciali durante la Fase s, che è la parte del ciclo cellulare in cui il DNA viene replicato. La maggior parte di questi metodi richiede di sincronizzare le cellule o di ordinarle in gruppi in base ai progressi della fase S, il che complica la preparazione dei campioni. Inoltre, le procedure per sincronizzare le cellule possono interferire con il processo di replicazione del DNA.

Un metodo chiamato analisi della frequenza dei marcatori (MFA)-seq può misurare direttamente quante copie di sequenze di DNA sono presenti in cellule in divisione attiva, ma ha una risoluzione limitata a causa del numero di cellule in replicazione attiva in qualsiasi momento. Inoltre, le tecniche di mapping RT esistenti possono essere costose. Ad esempio, mappare il RT di un piccolo genoma di lievito può costare fino a $1,000 in risorse.

#Introduzione al Nanotiming

Recentemente, sono stati sviluppati nuovi metodi per utilizzare un nucleoside speciale, 5-bromo-2’-deossuridina (BrdU), per tracciare la replicazione del DNA usando un metodo chiamato sequenziamento a nanopore. In varie cellule eucariotiche, il numero di trifosfato di desossitimidina (dTTP) aumenta durante la fase S. Questo ha portato all'idea di usare la quantità di BrdU trovata nelle letture del sequenziamento a nanopore per stimare il RT. Si prevede che ci sarà meno incorporazione di BrdU nelle regioni che si replicano più tardi rispetto a quelle che si replicano prima.

Il processo, chiamato Nanotiming, consente ai ricercatori di etichettare le cellule con BrdU per un singolo tempo di raddoppiamento, quindi quantificare il BrdU nelle letture a nanopore del genoma. Questo fornisce profili RT ad alta risoluzione senza la necessità di ordinare o sincronizzare le cellule, riducendo drasticamente i costi a circa $70 per profilo quando più campioni vengono sequenziati insieme. Questo metodo può allineare con precisione letture lunghe a nanopore a sequenze altamente ripetitive, fornendo un profilo RT completo da un capo all'altro del genoma.

#Metodologia del Nanotiming

Per testare questo metodo, i ricercatori hanno iniziato con una specie di lievito conosciuta come S. cerevisiae, utilizzata per studiare la replicazione del DNA eucariotico. Hanno usato un ceppo speciale di lievito che consente un'efficace incorporazione di BrdU. Sono state testate diverse concentrazioni di BrdU per trovare il livello più efficace per catturare l'aumento di dTTP durante la fase S.

Dopo aver esposto il lievito a diverse concentrazioni di BrdU per un tempo di raddoppiamento, i risultati hanno mostrato livelli variabili di BrdU tra le letture a nanopore. Le concentrazioni migliori sono risultate essere tra 5 e 20 µM di BrdU, poiché concentrazioni più elevate portavano a una saturazione di BrdU nel DNA. I ricercatori hanno poi confrontato i livelli medi di BrdU con i numeri di copia relativi ottenuti da sort-seq e hanno trovato una forte correlazione positiva, confermando che livelli più bassi di incorporazione di BrdU indicano regioni che si replicano più tardi.

Mantenendo una concentrazione costante di BrdU, i ricercatori hanno garantito che le cellule di lievito non subissero interruzioni nel loro timing di replicazione. Il contenuto medio di BrdU risultante corrispondeva da vicino ai profili ottenuti tramite sort-seq, dimostrando che il Nanotiming poteva creare mappe RT dettagliate del genoma di lievito senza la necessità di preparazioni di campioni complesse.

#Applicazioni del Nanotiming

I ricercatori hanno testato il Nanotiming su vari ceppi mutanti di lievito per vedere come l'assenza di certi regolatori di replicazione influenzasse il RT. Hanno mappato con successo il RT in ceppi privi di importanti proteine regolatrici, rivelando che l'assenza di Ctf19 causava il fatto che certe regioni si replicavano tardi, mentre la perdita di Rif1 spostava alcuni telomeri a replicarsi prima.

In modo interessante, studiando i telomeri dei cromosomi di lievito, hanno scoperto che non tutti i telomeri erano colpiti allo stesso modo dall'assenza di Rif1. Il metodo ha mostrato che Rif1 regola direttamente solo un sottoinsieme di telomeri, particolarmente quelli con specifiche sequenze subtelomeriche.

In un altro aspetto dei loro test, i ricercatori hanno analizzato le lunghezze di singoli telomeri insieme al loro timing di replicazione. Non hanno trovato una connessione chiara tra la lunghezza dei telomeri e il timing di replicazione, tranne che per una leggera tendenza in un ceppo mutante specifico. In generale, i telomeri mostravano un tempo di replicazione tardivo, ma alcuni telomeri avevano Tempi di replicazione più precoci indipendentemente dalle loro lunghezze.

#Efficienza dei Costi del Nanotiming

Uno dei vantaggi significativi del Nanotiming è la sua convenienza economica e il potenziale per applicazioni su larga scala. Utilizzando il sequenziamento multiphase, è possibile elaborare più campioni simultaneamente, abbattendo drasticamente il costo per profilo genomico. Questa accessibilità potrebbe consentire a molti laboratori di svolgere studi sul RT che prima erano limitati a causa di vincoli di risorse.

Al confronto, i metodi tradizionali richiedono risorse più estese e possono essere molto più costosi. La possibilità di eseguire molte analisi RT in un singolo run con costi minimi rende il Nanotiming una scelta pratica per i ricercatori.

#Conclusione: Il Futuro del Nanotiming

Il Nanotiming rappresenta un avanzamento significativo nel campo degli studi sulla replicazione cromosomica. Semplifica il processo di ottenimento di profili RT ad alta risoluzione e amplia il potenziale per analisi su larga scala. Il metodo porta chiarezza alle complessità della replicazione a livello di singoli telomeri e potrebbe portare a nuove intuizioni sui meccanismi che governano l'integrità cromosomica.

In generale, questo nuovo approccio non solo migliora la nostra comprensione di come si duplicano i cromosomi, ma apre anche la strada a applicazioni più ampie e a ricerche sui meccanismi di replicazione di vari organismi. Con la sua facilità d'uso e il basso costo, il Nanotiming è destinato a diventare uno strumento ampiamente adottato nello studio della replicazione del DNA e della dinamica della cromatina.