Metodi di rilevamento migliorati per i parassiti della malaria
Nuovi test migliorano la rilevazione dei parassiti della malaria nel Sudest asiatico.
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Indice
Plasmodium knowlesi è un parassita minuscolo che causa la malaria ed è presente nel sud-est asiatico. Di solito vive nelle scimmie e si diffonde tramite le zanzare. In Malesia, è la causa più comune di malaria nelle persone e può portare a malattie gravi, simile a un altro tipo di malaria causato da Plasmodium falciparum. Oltre a P. knowlesi, è stato rilevato anche un altro parassita strettamente correlato, P. cynomolgi, nelle infezioni umane.
Rilevare accuratamente questi parassiti è fondamentale per capire come si diffondono e per migliorare le misure adottate per controllare la malaria. Questo è particolarmente importante nelle aree dove esistono sia specie di malaria zoonotica (relativa agli animali) che non zoonotica (relativa agli esseri umani). Migliorare i metodi di Rilevamento è cruciale per i programmi nazionali che mirano a eliminare la malaria.
Sfide nel Rilevamento
I metodi tradizionali usati per diagnosticare la malaria, come la microscopia, spesso non riescono a identificare infezioni a basso livello. Non riescono a distinguere in modo affidabile diversi tipi di parassiti malarici quando sembrano simili al microscopio. Ad esempio, P. knowlesi può sembrare come P. malariae, e P. cynomolgi può facilmente essere confuso con P. vivax. I test rapidi che identificano le proteine del parassita presenti nel sangue non riescono a rilevare P. knowlesi a livelli bassi.
Negli ultimi anni, sono stati creati vari metodi molecolari per trovare P. knowlesi. Questi comportano l'uso di una tecnica chiamata PCR (Reazione a Catena della Polimerasi) per identificare il Materiale Genetico del parassita. Tuttavia, non c'è stata una comparazione approfondita su come si comportano questi metodi, specialmente nel rilevare basse quantità del parassita.
Raccolta e Test dei Campioni
Per migliorare i metodi di rilevamento, i ricercatori hanno raccolto campioni di sangue da pazienti con malaria e controlli sani in Malesia e Indonesia. Il sangue è stato prelevato prima di qualsiasi trattamento per garantire risultati accurati. Questi campioni sono stati congelati per test successivi. Inoltre, sono stati creati punti di sangue essiccato (DBS) usando piccole quantità di sangue e conservati adeguatamente per preservarne l’analisi futura.
L'esame microscopico dei campioni ha coinvolto tecnici esperti che hanno contato il numero di parassiti presenti. Questo ha aiutato a quantificare il livello di infezione da malaria in ciascun paziente.
Estrazione del Materiale Genetico
Il passo successivo ha coinvolto l'estrazione del materiale genetico totale dai campioni di sangue raccolti. Questo è stato fatto utilizzando un apposito kit progettato per l'estrazione del DNA. Per i punti di sangue essiccato, è stata utilizzata una metodologia diversa per garantire che il materiale genetico fosse ottenuto correttamente.
Dopo l'estrazione, i ricercatori hanno utilizzato la PCR per amplificare e identificare la presenza di marcatori genetici specifici della malaria. Questi test sono stati condotti in un laboratorio controllato per garantire l'accuratezza. I ricercatori hanno anche eseguito test per confermare quale tipo di parassita della malaria fosse presente in ciascun campione.
Valutazione dei Limiti di Rilevamento
I ricercatori intendevano capire quanto bene questi test potessero rilevare parassiti a livelli molto bassi. Per farlo, hanno diluito campioni contenenti quantità note di parassiti e testato questi campioni diluiti utilizzando sia metodi PCR standard che quelli che comprendevano un passaggio aggiuntivo di trascrizione inversa.
Questo passaggio extra è stato incluso per migliorare la sensibilità poiché può aiutare ad aumentare il rilevamento di infezioni a basso livello. I ricercatori hanno calcolato quanto basso potesse scendere il conteggio dei parassiti pur rimanendo rilevabile in modo affidabile.
Risultati della Valutazione
I risultati hanno mostrato che aggiungere il passaggio di trascrizione inversa ha migliorato significativamente la capacità di rilevare P. knowlesi e ha ridotto i limiti di rilevamento a livelli molto più bassi rispetto a quelli ottenuti con i metodi standard. Questo miglioramento indica che utilizzare la trascrizione inversa potrebbe aiutare a trovare parassiti nelle fasi iniziali di infezione, quando è meno probabile che vengano rilevati dai metodi tradizionali.
La sensibilità dei test variava tra i diversi tipi di malaria. I test per P. knowlesi hanno mostrato risultati particolarmente buoni, dimostrando che questo metodo potrebbe rilevare in modo affidabile anche livelli molto bassi di parassiti.
Cosa Significa per la Salute Pubblica
I risultati di questi test sono essenziali per la salute pubblica nelle regioni dove la malaria è un problema. Con metodi di rilevamento migliori, i professionisti sanitari saranno in grado di identificare i casi di malaria in modo più accurato, inclusi quelli asintomatici o presenti a livelli bassi.
Comprendere la reale estensione della trasmissione della malaria aiuterà nella pianificazione delle strategie di controllo ed eliminazione. Questo è particolarmente importante nel sud-est asiatico, dove la malaria zoonotica rappresenta una minaccia significativa.
Sfide Future
Nonostante questi risultati promettenti, ci sono ancora sfide da affrontare. Sebbene i nuovi test mostrino un miglioramento nel rilevamento, la necessità della trascrizione inversa aggiunge complessità e potrebbe aumentare i costi. Questo può limitare il loro utilizzo in contesti a risorse limitate. Inoltre, la stabilità del materiale genetico nei campioni di sangue può degradarsi nel tempo, rendendo necessario utilizzare campioni freschi per i migliori risultati.
Inoltre, la ricerca non ha incluso tutti i possibili tipi di malaria, il che significa che alcuni potrebbero ancora essere più difficili da rilevare. La capacità di differenziare tra parassiti strettamente correlati rimane un'importante area per studi futuri.
Conclusione
In sintesi, i progressi nei metodi di rilevamento molecolare per parassiti della malaria come P. knowlesi sono vitali per controllare e prevenire la malaria, specialmente nelle regioni dove esistono sia specie umane che zoonotiche. L'uso di tecniche che includono la trascrizione inversa mostra grandi promesse nel migliorare le capacità diagnostiche. Man mano che questi metodi diventano più raffinate, probabilmente svolgeranno un ruolo chiave negli sforzi globali per eliminare la malaria e proteggere la salute pubblica. Un rilevamento migliorato delle infezioni a basso livello porterà infine a una migliore comprensione delle dinamiche di trasmissione della malaria e aiuterà a informare strategie efficaci per il controllo della malaria.
Questa ricerca in corso è cruciale per affrontare le sfide di salute pubblica poste dalla malaria nel sud-est asiatico e per garantire che diagnosi accurate e tempestive possano essere effettuate per combattere efficacemente la malattia.
Titolo: Improved limit of detection for zoonotic Plasmodium knowlesi and P. cynomolgi surveillance using reverse transcription for total nucleic acid preserved samples or dried blood spots
Estratto: BackgroundZoonotic P. knowlesi and P. cynomolgi symptomatic and asymptomatic infections occur across endemic areas of Southeast Asia. Most infections are low-parasitemia, with an unknown proportion below routine microscopy detection thresholds. Molecular surveillance tools optimizing the limit of detection (LOD) would allow more accurate estimates of zoonotic malaria prevalence. MethodsAn established ultra-sensitive Plasmodium genus quantitative-PCR (qPCR) assay targeting the 18S rRNA gene underwent LOD evaluation with and without reverse transcription (RT) for P. knowlesi, P. cynomolgi and P. vivax using total nucleic acid preserved (DNA/RNA ShieldTM) isolates and archived dried blood spots (DBS). LODs for selected P. knowlesi-specific assays, and reference P. vivax- and P. cynomolgi-specific assays were determined with RT. Assay specificities were assessed using clinical malaria samples and malaria-negative controls. ResultsThe use of reverse transcription improved Plasmodium species detection by up to 10,000-fold (Plasmodium genus), 2759-fold (P. knowlesi), 1000-fold (P. vivax) and 10-fold (P. cynomolgi). The median LOD with RT for the Kamau et al. Plasmodium genus RT-qPCR assay was [≤]0.0002 parasites/{micro}L for P. knowlesi and 0.002 parasites/{micro}L for both P. cynomolgi and P. vivax. The LODs with RT for P. knowlesi-specific PCRs were: Imwong et al. 18S rRNA (0.0007 parasites/{micro}L); Divis et al. real-time 18S rRNA (0.0002 parasites/{micro}L); Lubis et al. hemi-nested SICAvar (1.1 parasites/{micro}L) and Lee et al. nested 18S rRNA (11 parasites/{micro}L). The LOD for P. vivax- and P. cynomolgi-specific assays with RT were 0.02 and 0.20 parasites/{micro}L respectively. For DBS P. knowlesi samples the median LOD for the Plasmodium genus qPCR with RT was 0.08, and without RT was 19.89 parasites/uL (249-fold change); no LOD improvement was demonstrated in DBS archived beyond 6 years. The Plasmodium genus and P. knowlesi-assays were 100% specific for Plasmodium species and P. knowlesi detection, respectively, from 190 clinical infections and 48 healthy controls. Reference P. vivax-specific primers demonstrated known cross-reactivity with P. cynomolgi. ConclusionOur findings support the use of an 18S rRNA Plasmodium genus qPCR and species-specific nested PCR protocol with RT for highly-sensitive surveillance of zoonotic and human Plasmodium species infections. Author SummaryThe monkey malaria parasite Plasmodium knowlesi has been found to increasingly infect humans across Southeast Asia via the bite of its anopheline mosquito vectors. Human infections with a similar monkey parasite, Plasmodium cynomologi, have also been reported. The diagnostic tools commonly used to detect these malaria species are often unable to detect very low-level infections. We aimed to to improve surveillance detection tools and blood sample collection methods to detect these zoonotic malaria species and understand the extent of transmission and the burden of disease. This study validated and compared the use of molecular laboratory assays targeting these species. We found that with the use of reverse transcription, large improvements in the limit of detection were possible, by up to 10,000-fold for initial malaria screening, and up to 2759-fold for specific P. knowlesi detection. Findings from this study support the use of ultrasensitive detection tools to improve surveillance approaches to emerging zoonotic malaria species.
Autori: Matthew J Grigg, K. A. Braima, K. A. Piera, I. N. Lubis, R. Noviyanti, G. S. Rajahram, P. Kariodimedjo, I. R. Nainggolan, R. Permatasari, L. Trianty, R. Amalia, S. S. Sakam, A. F. Tan, T. William, J. A. Westaway, P. C. Lee, S. Daim, H. Surendra, N. Christy, A. G. Letizia, C. L. Peatey, M. A. Moideen, B. Barber, C. J. Sutherland, N. M. Anstey
Ultimo aggiornamento: 2024-04-08 00:00:00
Lingua: English
URL di origine: https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2024.04.04.24305339
Fonte PDF: https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2024.04.04.24305339.full.pdf
Licenza: https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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