Orologi circadiani: espressione genica nel fegato dei topi

Gli Orologi circadiani nei mammiferi sono sistemi interni che regolano i processi biologici su un ciclo di 24 ore. Questi orologi controllano i livelli di molecole specifiche, come RNA e proteine, durante il giorno. Al centro di questi orologi ci sono geni che influenzano varie funzioni corporee, tra cui sonno, metabolismo e rilascio di ormoni.

#Il Ruolo dei Geni Chiave

Due proteine importanti che guidano questi orologi circadiani sono BMAL1 e CLOCK. Lavorano insieme per attivare altri geni come Cry e Per. Le proteine prodotte da questi geni inibiscono poi l'attività di BMAL1 e CLOCK, creando un ciclo di feedback che aiuta a mantenere il tempo di questi processi biologici.

#Interazione con Luce e Alimentazione

Nei mammiferi, ci sono molti orologi individuali in diverse cellule e tessuti. Questi orologi sono influenzati sia dalla luce che da altri segnali, come schemi di alimentazione e digiuno. Ad esempio, nel fegato, l'orologio circadiano interagisce con i cicli di alimentazione per gestire l'espressione di migliaia di geni importanti per il metabolismo.

#Importanza della Regolazione Circadiana

Le interruzioni dell'orologio circadiano, che siano dovute a fattori ambientali o problemi genetici, possono portare a varie malattie metaboliche. Quindi, capire come funzionano questi orologi interni è fondamentale per prevenire problemi di salute.

#Progressi nelle Tecniche di Ricerca

Un certo numero di studi si è concentrato su come l'attività genica cambia nel tempo nei tessuti epatici dei topi. Tuttavia, molti di questi studi hanno esaminato solo singoli geni o parti di geni a causa di limitazioni tecniche. Spostare l'attenzione verso l'analisi di trascritti completi o isoforme potrebbe fornire approfondimenti più profondi su come i ritmi circadiani influenzano l'espressione genica.

#Importanza delle Isoforme di Trascritti

Le isoforme di trascritti sono versioni diverse dello stesso gene che possono avere funzioni distinte. Includono sequenze codificanti complete e indicano dove inizia la trascrizione del gene. Comprendere queste isoforme può mostrare come i geni producono diverse proteine che regolano varie funzioni corporee.

#Nuova Tecnologia di Sequenziamento

I recenti progressi nella tecnologia di sequenziamento consentono il sequenziamento completo delle molecole di RNA, rendendo possibile studiare queste isoforme in modo più accurato. Questa tecnologia offre una visione complessiva del trascrittoma, o la somma di tutte le molecole di RNA prodotte in una cellula.

#Il Nostro Approccio alla Ricerca

Abbiamo utilizzato questa tecnica avanzata di sequenziamento chiamata R2C2 per esaminare come l'orologio circadiano influenzi l'espressione genica a livello di isoforma nel fegato dei topi. Questo metodo ci ha permesso di raccogliere un gran numero di sequenze RNA accurate in diversi momenti della giornata.

#Impostazione Sperimentale

I topi maschi sono stati mantenuti su un ciclo di luce/buio di 12 ore e poi posti in oscurità costante. Sono stati sacrificati in coppie a intervalli regolari per raccogliere campioni di fegato. Questa impostazione ci ha permesso di monitorare le variazioni nell'attività genica su un intero ciclo circadiano.

#Generazione e Analisi dei Dati

Abbiamo creato librerie di cDNA a lunghezza completa dall'RNA estratto dai fegati dei topi. Abbiamo utilizzato un metodo specifico per preparare questi campioni per il sequenziamento, assicurandoci di catturare un'ampia gamma di dimensioni dei trascritti. Sequenziando i campioni con tecnologia avanzata, abbiamo generato milioni di letture RNA accurate.

#Quantificazione dell'Attività Genica

Per confermare che il nostro metodo potesse rilevare efficacemente le variazioni nell'attività genica, abbiamo analizzato geni circadiani noti. Abbiamo scoperto che i livelli di espressione di questi geni oscillavano come previsto nel corso dell'esperimento. I nostri risultati hanno mostrato un'alta concordanza con studi precedenti che utilizzavano metodi di sequenziamento diversi.

#Analisi su Genoma Completo

Successivamente, abbiamo ampliato la nostra analisi per esaminare il comportamento di tutti i geni nel nostro dataset. Utilizzando strumenti computazionali specializzati, abbiamo trovato oltre mille geni che mostrano modelli di espressione oscillanti. Questi modelli erano coerenti con i noti ritmi circadiani e corrispondevano a quelli trovati in altri studi.

#Transizione all'Analisi delle Isoforme

Il sequenziamento R2C2 non solo consente un'analisi a livello genico, ma offre anche un'opportunità unica per esplorare le isoforme di trascritti. Questo significa che potevamo analizzare l'intero spettro dei cambiamenti di espressione genica, comprese le varianti specifiche di ciascun gene.

#Identificazione e Quantificazione delle Isoforme

Utilizzando i nostri dati RNA, siamo riusciti a identificare e quantificare migliaia di diverse isoforme. Ciò includeva molte che non erano state precedentemente annotate in database esistenti. La nostra analisi ha rivelato che una parte significativa delle isoforme era espressa a livelli bassi.

#Rilevamento delle Oscillazioni delle Isoforme

Abbiamo ulteriormente esplorato come queste isoforme cambiavano durante il ciclo circadiano. Oltre mille isoforme sono state trovate a mostrare modelli oscillanti. Curiosamente, molti geni producevano sia isoforme oscillanti che non oscillanti. Questo mix può influenzare i modelli di espressione complessivi a livello genico.

#Analisi delle Sequenze Codificanti

Successivamente, ci siamo concentrati sulle sequenze codificanti, che sono segmenti di RNA che forniscono istruzioni per la produzione di proteine. Abbiamo combinato i dati delle diverse isoforme per valutare l'espressione delle singole sequenze codificanti. Questo ha fornito un quadro più chiaro di come si comportano le sequenze codificanti durante il ciclo circadiano.

#Osservazione delle Oscillazioni delle Sequenze Codificanti

Abbiamo identificato diverse sequenze codificanti che oscillavano durante la giornata. La maggior parte di queste era associata a geni noti per mostrare comportamenti circadiani. Abbiamo anche analizzato le relazioni tra queste sequenze codificanti e i rispettivi geni per fornire ulteriori approfondimenti.

#Investigazione dei Punti di Inizio della Trascrizione

I punti di inizio della trascrizione (TSS) sono cruciali per capire dove inizia l'espressione genica. Abbiamo usato i nostri dati per identificare molti TSS e valutare la loro attività durante il ritmo circadiano. Questo ci ha aiutato a comprendere come l'inizio della trascrizione possa essere regolato durante la giornata.

#Validazione dei Punti di Inizio della Trascrizione

Utilizzando dati di riferimento disponibili, abbiamo confermato che i TSS identificati corrispondevano bene a noti marcatori di trascrizione attiva. Questa validazione ci ha permesso di procedere con l'indagine delle oscillazioni dei TSS.

#Esame delle Oscillazioni dei TSS

Abbiamo trovato molti TSS che mostrano modelli oscillanti e abbiamo collegato questi modelli a geni specifici. Queste oscillazioni spesso rispecchiavano il comportamento dei marcatori epigenetici, indicando una relazione tra trascrizione e questi elementi regolatori.

#Comprensione dell'Attività dei Fattori di Trascrizione

I fattori di trascrizione (TF) sono proteine che regolano l'espressione dei geni. Abbiamo cercato di capire come questi fattori interagissero con i TSS oscillanti per influenzare l'attività di trascrizione. Analizzando i dati di legame dei TF esistenti, abbiamo potuto vedere i modelli di attività dei TF durante il ciclo circadiano.

#Arricchimento dei Fattori di Trascrizione

Abbiamo osservato che certi fattori di trascrizione, in particolare quelli coinvolti nel meccanismo circadiano centrale, mostrano un sovrapposizione significativa con i TSS oscillanti. Questo indica che giocano un ruolo cruciale nel regolare l'espressione genica in diversi momenti del ciclo di 24 ore.

#Conclusione

Attraverso tecnologie di sequenziamento innovative e analisi dati complete, abbiamo ottenuto preziosi approfondimenti sulla dinamica dell'espressione genica circadiana nel fegato dei topi. Il nostro approccio ci ha permesso di scoprire i ruoli delle isoforme, delle sequenze codificanti e dei TSS, fornendo una comprensione più dettagliata di come i processi biologici oscillano nel tempo. Questo studio sottolinea il potenziale per future ricerche per esplorare ulteriormente le sfumature della biologia circadiana, aprendo la strada a scoperte nella gestione della salute e delle malattie.

#Direzioni Future

Anche se il nostro studio ha prodotto risultati significativi, ci sono sfide tecniche che devono essere affrontate nella ricerca successiva. Aumentare la quantità di letture raccolte migliorerà il rilevamento delle isoforme espresse a bassi livelli, e utilizzare tecniche avanzate potrebbe migliorare la capacità di catturare trascritti RNA più lunghi.

Continuando a perfezionare questi metodi e conducendo studi simili in vari tessuti, i ricercatori possono sviluppare una comprensione più completa dei ritmi circadiani e delle loro implicazioni per la salute generale.

#Metodi

Estrazione dell'RNA e Sintesi del cDNA

L'RNA totale è stato estratto da campioni di fegato congelati utilizzando un protocollo standard. Per la sintesi del cDNA, l'RNA è stato mescolato con i componenti necessari per la trascrizione inversa, seguito dalla sintesi del secondo filamento e amplificazione tramite PCR.

Preparazione della Libreria R2C2

Le librerie per il sequenziamento sono state preparate usando un metodo specifico che circolarizza il cDNA, consentendo una maggiore accuratezza di sequenziamento. La selezione delle dimensioni ha assicurato che un'ampia gamma di lunghezze dei trascritti fosse inclusa nelle librerie finali.

Sequenziamento ONT e Elaborazione dei Dati

Abbiamo effettuato il sequenziamento su celle di flusso specializzate e processato i dati risultanti utilizzando strumenti bioinformatici avanzati. Questo ha comportato allineamento ai genomi di riferimento e quantificazione dell'espressione genica a diversi livelli.

Analisi e Visualizzazione dei Dati

La nostra analisi dei dati di lettura risultanti ha fornito approfondimenti sui comportamenti di geni, isoforme, sequenze codificanti e punti di inizio della trascrizione. Gli strumenti di visualizzazione hanno aiutato a chiarire le relazioni tra questi elementi attraverso il ciclo circadiano.

Fornendo questi metodi e risultati dettagliati, puntiamo a rendere il nostro studio accessibile a un ampio pubblico, incoraggiando ulteriori esplorazioni e ricerche sulla biologia circadiana.