L'interférence par ARN révèle des gènes clés dans la méiose femelle

Les écrans génétiques sont des outils importants pour découvrir quels gènes sont nécessaires pour différents processus biologiques. Les scientifiques ont utilisé ces écrans pour étudier les problèmes de Méiose femelle, un type spécial de division cellulaire. Certains chercheurs ont utilisé des mutants trouvés dans des populations naturelles, tandis que d'autres ont créé des mutations avec des produits chimiques ou des méthodes spéciales qui insèrent de nouveaux gènes dans les Chromosomes. La plupart de ces écrans se concentraient sur la création de chromosomes mutants homozygotes, c'est-à-dire qu'ils avaient deux copies identiques d'un gène. Cette méthode était utile pour trouver des mutations récessives qui entraînaient des problèmes comme la production de trop de descendants anormaux à cause de la non-disjonction méiotique.

Bien que cette méthode soit efficace, elle avait ses limites. Le fait que les mutants femelles doivent être viables et fertiles signifiait que les mutations létales ou celles causant la stérilité ne pouvaient pas être détectées. De plus, elle n'identifiait que les mutations qui causaient spécifiquement une non-disjonction, négligeant d'autres problèmes potentiels. Une amélioration est venue avec l'utilisation d'une technique qui crée des clones germinaux homozygotes par un processus appelé recombinaison mitotique. Cette méthode a permis aux chercheurs de rendre des chromosomes spécifiques homozygotes dans les cellules germinales tout en les gardant hétérozygotes dans le reste du corps, leur permettant d'étudier des mutations qui seraient normalement létales.

Une autre avancée a impliqué l'utilisation d'interférence par ARN (ARNi) pour réduire l'activité de gènes spécifiques de manière ciblée. L'ARNi tire parti d'un mécanisme de défense naturel dans les cellules, introduisant une séquence qui correspond au gène cible. Cela conduit à la dégradation de l'ARN messager (ARNm) pour ce gène, réduisant efficacement ses niveaux. Dans de nombreux cas, cela peut diminuer l'expression des gènes de 80 à 95%. Chez les drosophiles, les scientifiques ont créé des collections de constructions ARNi qui peuvent être activées dans des tissus spécifiques, leur permettant d'examiner les effets des mutations qui seraient normalement létales.

En utilisant cette méthode, les chercheurs de notre labo ont étudié deux événements clés qui se produisent durant les premières étapes de la méiose femelle. Le premier est la congrégation des chromosomes, c'est-à-dire comment les chromosomes se déplacent et s'alignent correctement pendant la division cellulaire. Les drosophiles ont leur oogenèse divisée en 14 étapes selon leur développement. La transition de l'étape 12 à 13 marque la fin d'une phase de division cellulaire et le début d'une autre. Pendant ce temps, des structures de fuseau se forment et les chromosomes commencent à se séparer.

Sans points d'échange, appelés chiasmata, les chromosomes non échangés restent connectés. Ces chromosomes se déplacent vers des côtés opposés du fuseau. Finalement, ils devraient se rassembler au niveau de la plaque métaphasique pour former une structure compacte avant la division cellulaire. Si cette congrégation ne se passe pas correctement, des problèmes comme l'aneuploïdie peuvent apparaître, entraînant des gamètes avec un nombre incorrect de chromosomes.

#Étude des Filaments Ooplasmiques

Le deuxième axe de notre recherche est la compréhension des filaments ooplasmiques, observés pour la première fois lorsque des protéines spécifiques s'y localisent. Ces filaments apparaissent peu après la rupture de la vésicule germinale et semblent se désassembler peu après que l'œuf soit activé et fécondé. Certaines protéines montrent un comportement dynamique, s'attachant à ces filaments en réponse à des changements environnementaux.

Les chercheurs ont utilisé des techniques d'imagerie spéciales pour visualiser ces filaments et ont remarqué qu'ils ont une structure unique. Cependant, malgré les efforts pour identifier les protéines qui forment ces filaments, il reste flou de quoi ils sont exactement composés, ce qui complique la compréhension de leurs rôles dans les processus méiotique.

Dans notre labo, nous avons réalisé un criblage cytologique pour tester une collection de constructions ARNi afin de trouver des gènes essentiels pour ces deux processus dans la méiose femelle. Nous nous sommes concentrés sur l'analyse des œufs non fécondés pour identifier les gènes qui auraient pu causer la létalité s'ils avaient été étudiés de manière traditionnelle. Cela a impliqué de croiser des mâles d'une lignée ARNi spécifique avec des femelles exprimant des drivers spécifiques pour induire l'ARNi de certains gènes cibles. Les Ovocytes ont ensuite été examinés au microscope pour identifier d'éventuels défauts dans leur développement.

Le défaut de congrégation conduirait à plusieurs masses de chromosomes, tandis que les défauts dans les filaments montreraient une absence complète de filaments ou des changements majeurs dans leur structure. Étant donné que des écrans ARNi précédents avaient identifié plusieurs gènes entraînant un échec dans la formation des œufs, nous avons re-teste ces lignées avec un driver différent qui s'active plus tard dans le développement des œufs.

#Processus de Criblage

Nous avons cribé plus de 1 400 constructions ARNi, découvrant des gènes connus et inconnus liés à la méiose. Beaucoup des gènes que nous avons testés n'avaient pas été examinés auparavant, et nous avons reconnu que des mutants méiotique précédemment connus pouvaient servir de témoins précieux dans notre analyse. Parmi les constructions testées, nous avons enregistré de nombreux résultats négatifs ; cependant, nous avons réussi à identifier plusieurs lignées avec des défauts intéressants.

Le processus de criblage nous a permis de séparer les lignées en différentes catégories. La première catégorie comprenait des résultats négatifs, où aucun défaut n'était noté. La deuxième catégorie incluait des lignées non testables, c'est-à-dire qui ne produisaient aucun ovocyte mature. La troisième catégorie comprenait des lignées qui n'affichaient aucun défaut dans les ovocytes lors des tests. Enfin, nous avons identifié une catégorie de lignées avec des résultats spécifiques montrant des défauts, que nous sommes particulièrement intéressés à étudier davantage.

#Caractéristiques des Défauts de Congréation

Le défaut de congrégation que nous avons observé impliquait des chromosomes méiotique incapables de se rassembler en une seule masse, résultant en plusieurs masses d'ADN au stade où les œufs étaient arrêtés avant la division. Nous avons noté des problèmes comme la dégradation des chromosomes méiotique ou des structures anormales, telles que des arrangements incorrects d'hétérochromatine.

#Méthodologie de Criblage

Pour faciliter notre criblage, nous avons utilisé une approche systématique. Nous avons commandé des lignées ARNi et les avons croisées avec des stocks de testeurs appropriés pour évaluer les phénotypes. Après les croisements, nous avons disséqué les ovaires, les avons fixés et teintés les échantillons pour observation au microscope. Le processus rationalisé nous a permis d'analyser de nombreux échantillons efficacement.

Nos résultats ont indiqué que beaucoup des gènes identifiés étaient vitaux pour la méiose, un nombre significatif de lignées étant stériles ou semi-stériles lorsque l'ARNi était induit. Cela a confirmé notre hypothèse que les méthodes de criblage traditionnelles avaient peut-être manqué de nombreux gènes critiques en raison de leurs effets létaux ou de stérilité.

#Résultats du Criblage

Nous avons catégorisé les résultats de nos efforts de criblage en groupes basés sur la présence ou l'absence de défauts. De nombreuses lignées ont produit des ovocytes notables sans défauts, tandis que d'autres sont tombées dans la catégorie non testable. Un plus petit nombre montrait des défauts clairs dans les processus cellulaires que nous étudiions.

Parmi les résultats que nous avons identifiés, nous avons observé plusieurs gènes jusqu'alors non caractérisés, élargissant notre compréhension du paysage génétique lié à la méiose femelle.

#Analyse de l'Ontologie Génétique

Pour analyser nos résultats plus en profondeur, nous avons effectué une analyse de l'Ontologie Génétique pour voir à quels processus biologiques appartiennent les gènes. Nous avons découvert que les gènes variaient largement en fonction, beaucoup étant associés au métabolisme des ARN. Certains gènes étaient impliqués dans des processus essentiels pour les événements méiotique et du cycle cellulaire, tandis que d'autres jouaient des rôles critiques dans l'organisation des composants cellulaires.

#Conclusion

Cette étude a mis en évidence l'utilité de l'utilisation de l'interférence par ARN comme un outil puissant pour identifier des gènes importants impliqués dans la méiose femelle. En nous concentrant sur la Lignée germinale, nous avons réussi à identifier des candidats pour des recherches futures. Bien que nous ayons rencontré plusieurs défis avec la validation et les effets potentiels hors cible, les idées acquises informeront les futures investigations et aideront à découvrir les mécanismes sous-jacents de la méiose.

Nos découvertes ouvrent des portes pour une exploration continue des facteurs génétiques en jeu lors de la méiose, notamment pour identifier les composants structuraux essentiels au bon fonctionnement cellulaire dans l'ovocyte en développement. Les résultats et catégories établis par le biais de ce criblage fourniront une base pour de futures études dans le domaine, ce qui fera progresser notre compréhension de la complexité de la méiose et de sa régulation génétique.