Avancées dans l'édition génétique avec des cellules souches

Les cellules souches sont des cellules spéciales dans notre corps qui peuvent se transformer en plein de types différents de cellules. Elles sont super importantes pour la recherche parce qu'elles peuvent nous aider à comprendre les maladies et à tester de nouveaux médicaments. Un type de cellule souche s'appelle les cellules souches pluripotentes humaines (HPSCs), qui peuvent devenir presque n'importe quel type de cellule dans le corps. Les scientifiques utilisent ces cellules pour étudier les maladies et chercher de nouveaux traitements.

L'édition génétique est une méthode qu'utilisent les scientifiques pour changer l'ADN dans les cellules. Un outil populaire pour l'édition génétique s'appelle CRISPR/Cas9. Cet outil permet aux chercheurs d'éliminer ou de modifier des gènes spécifiques dans l'ADN. En utilisant CRISPR/Cas9 sur les hPSCs, les scientifiques peuvent créer des modèles de maladies pour mieux comprendre comment elles fonctionnent et tester des traitements potentiels.

#Qu'est-ce que le knockout génétique ?

Le knockout génétique est une méthode que les chercheurs utilisent pour comprendre ce qui se passe quand un gène spécifique est désactivé ou retiré. C'est important parce que certains gènes peuvent causer des maladies quand ils ne fonctionnent pas correctement. En créant un knockout dans les hPSCs, les scientifiques peuvent observer comment l'absence d'un gène affecte les cellules. Ça peut mener à des insights sur comment les maladies se développent et comment elles peuvent être traitées.

CRISPR/Cas9 est souvent utilisé pour créer des knockouts génétiques. Le système cible une partie spécifique de l'ADN pour créer des coupures, menant à des changements dans le gène. Quand l'ADN essaie de se réparer, ça peut entraîner de petits changements, connus sous le nom d'insertion ou de délétion (INDELs), qui peuvent perturber la fonction du gène.

#Défis de l'édition génétique dans les cellules souches

En utilisant CRISPR/Cas9 dans les hPSCs, les scientifiques ont rencontré plusieurs défis. Lors des premières expériences, l'efficacité du knockout génétique était très basse-seulement environ 1-2%. C'était parce que les hPSCs résistent souvent aux changements dans leur ADN, ce qui rend difficile pour les chercheurs d'éditer les gènes avec succès.

Au fil du temps, les scientifiques ont essayé différentes méthodes pour améliorer ce processus. Ils ont cherché comment mieux livrer l'outil CRISPR dans les cellules, conçu des guides plus efficaces et testé différentes méthodes pour amener les cellules à accepter les changements. Certaines nouvelles stratégies impliquaient d'utiliser différentes formes de CRISPR, comme des complexes ribonucléoprotéiques (RNP) de Cas9 ou des versions modifiées de Cas9 pouvant être activées par un médicament appelé doxycycline (Dox).

#Le système hPSCs-iCas9 optimisé

Dans cette recherche, un nouveau système a été développé, appelé le système hPSCs-iCas9 optimisé. Ce système a considérablement amélioré l'efficacité du knockout génétique dans les hPSCs. Les chercheurs ont apporté des ajustements à plusieurs facteurs, comme la façon dont les cellules étaient traitées et le moment où les outils d'édition étaient introduits.

Après avoir fait ces ajustements, ils ont réussi à obtenir une impressionnante efficacité INDEL de 82% à 93% dans les expériences de knockout génétique. Cela signifie qu'un pourcentage beaucoup plus élevé des hPSCs avait réussi à avoir les gènes éliminés par rapport aux méthodes précédentes.

#Aborder les défis dans la conception de sgRNA

Une partie critique de l'utilisation de CRISPR/Cas9 est la conception des ARN guides (sgRNAs) qui indiquent au système où couper l'ADN. Il y a beaucoup de ressources en ligne pour aider à concevoir ces sgRNAs, mais il y a des défis. Toutes les prédictions de ces outils ne sont pas précises, ce qui peut entraîner le choix de sgRNAs inefficaces.

Pour y remédier, les chercheurs ont testé divers sgRNAs pour voir comment ils se comportaient dans de vraies expériences par rapport à leurs scores prévus. Ils ont découvert que certains outils de conception étaient plus fiables que d'autres, les aidant à choisir de meilleurs sgRNAs pour de futures expériences.

#Vérification de l'expression des protéines

Après avoir utilisé des sgRNAs pour créer des cellules knockout, il est essentiel de vérifier si les protéines cibles sont toujours fabriquées. Cette étape est importante parce que parfois, malgré l'édition de l'ADN, la protéine peut encore être présente en raison de diverses raisons comme le splicing alternatif ou d'autres mécanismes cellulaires.

Pour s'assurer que les bons sgRNAs avaient été choisis, les chercheurs ont utilisé une technique appelée Western blotting pour détecter les protéines dans les cellules éditées. En faisant ça, ils pouvaient voir quels sgRNAs étaient efficaces pour éliminer les protéines cibles et lesquels ne l'étaient pas.

#Processus étape par étape de la recherche

#1. Préparation des cellules souches

Les chercheurs ont utilisé des types spécifiques de hPSCs, qui ont été cultivées dans des conditions contrôlées. Les cellules étaient régulièrement vérifiées pour assurer qu'elles étaient en bonne santé et sans contamination.

#2. Création des lignées hPSCs-iCas9

L'étape suivante a été d'introduire le système Cas9 dans les hPSCs. Cela a été fait en insérant un morceau spécial d'ADN contenant les instructions pour la protéine Cas9 à un endroit sûr dans le génome de la cellule souche. Après l'introduction, les cellules ont été sélectionnées en fonction de leur capacité à survivre et à porter le nouveau gène.

#3. Conception de sgRNAs

Les chercheurs ont conçu plusieurs sgRNAs ciblant différents gènes en se basant sur des prédictions d'outils de conception. Ils ont veillé à ce que ces sgRNAs soient adaptés aux tâches d'édition génétique qu'ils visaient à réaliser.

#4. Nucleofection

La nucleofection a été la méthode choisie pour livrer les sgRNAs dans les hPSCs. Cette technique utilise des impulsions électriques pour aider les sgRNAs à entrer dans les cellules plus efficacement.

#5. Test et amélioration

Après la nucleofection, les chercheurs ont vérifié l'efficacité des modifications génétiques. Ils ont répété ce processus plusieurs fois avec des paramètres ajustés pour voir s'ils pouvaient obtenir des résultats encore meilleurs. À chaque round de test, ils ont appris davantage sur ce qui fonctionnait et ce qui ne fonctionnait pas.

#Différenciation des cellules souches en cardiomyocytes

Une fois leur système optimisé opérationnel, les chercheurs ont concentré leur attention sur la différenciation des hPSCs mutants en cardiomyocytes (cellules cardiaques). Cette étape est cruciale pour modéliser les maladies cardiaques puisque cela permet d'étudier les effets des maladies sur des types de cellules spécifiques.

Les chercheurs ont suivi un protocole spécifique pour encourager les hPSCs à se transformer en cardiomyocytes. Ils ont observé une grande pureté des cellules de cardiomyocytes, s'assurant que les modèles créés étaient adaptés pour étudier les maladies cardiaques.

#Dysfonction mitochondriale dans la modélisation de maladies

Les chercheurs se sont concentrés sur une maladie spécifique appelée syndrome de Barth, qui est connue pour provoquer une dysfonction mitochondriale à cause de mutations génétiques spécifiques. En utilisant leur système hPSCs-iCas9 pour éliminer le gène TAZ, ils ont créé un modèle pour étudier les effets de cette perte de gène sur les cellules cardiaques.

Une fois les cardiomyocytes knockout créés, ils ont évalué le bon fonctionnement des cellules. Ils ont découvert que ces cellules knockout montraient des problèmes mitochondriaux significatifs, connus pour se produire chez les patients atteints du syndrome de Barth.

#Comparaison des méthodes de livraison

En étudiant l'efficacité de l'édition génétique dans les cardiomyocytes, les chercheurs ont testé différentes méthodes de livraison des composants CRISPR. Ils ont trouvé que les méthodes traditionnelles avec liposomes ne donnaient pas de bons résultats dans ces cellules différenciées.

Cette découverte suggère que les méthodes de livraison populaires actuelles peuvent ne pas convenir à tous les types de cellules, et qu'une optimisation supplémentaire est nécessaire pour une édition génétique efficace dans des cellules spécialisées comme les cardiomyocytes.

#Validation de l'efficacité de l'édition

Les chercheurs voulaient aussi s'assurer que leurs méthodes d'édition génétique étaient précises. Ils ont comparé trois outils d'analyse différents pour voir lequel fournissait les meilleurs résultats pour comprendre l'efficacité de leurs modifications. Ils ont constaté que certains outils fonctionnaient mieux que d'autres, leur permettant de mieux comprendre comment certains sgRNAs ont performé.

#Applications pratiques et directions futures

Les avancées réalisées par les chercheurs dans l'édition génétique des hPSCs représentent un grand pas en avant dans le domaine de la médecine régénérative. Cette approche optimisée pour le knockout génétique peut mener à de meilleurs modèles pour étudier les maladies, aidant à tester de nouveaux médicaments plus efficacement.

En regardant vers l'avenir, cette plateforme peut être étendue à d'autres types de modifications génétiques, comme des mutations ponctuelles ciblées ou des délétions plus importantes, ce qui pourrait encore améliorer son utilité dans la recherche génétique.

À mesure que le domaine continue de croître, les chercheurs auront la capacité de mieux comprendre la complexité des maladies génétiques et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les combattre. Le but est de rendre les stratégies avancées d'édition génétique accessibles et pratiques pour une large gamme d'applications scientifiques.

#Conclusion

La recherche décrite a fait des progrès considérables dans l'amélioration des méthodes d'édition génétique dans les hPSCs. En développant le système hPSCs-iCas9 optimisé, les scientifiques ont ouvert de nouvelles portes pour étudier les maladies et tester des traitements. Avec des efforts et des ajustements continus, cette technologie pourrait devenir un outil essentiel dans la lutte contre divers troubles génétiques, menant finalement à de meilleurs résultats de santé.