Faire avancer l'ingénierie des protéines avec des acides aminés non canonique

Dans le monde des protéines, il y a des éléments de base appelés acides aminés qui se regroupent pour former des chaînes, et la structure de ces chaînes est super importante pour le fonctionnement d'une protéine. La plupart du temps, on se contente des incontournables, les acides aminés canonicals. Mais il y a quelques personnages un peu particuliers, appelés acides aminés non canonicals (ncAAs), qui peuvent vraiment changer la donne. Ces ncAAs peuvent donner aux protéines de nouvelles capacités ou les aider à mieux faire leur boulot. Les scientifiques ont trouvé une méthode pour introduire ces ncAAs dans les protéines dans des cellules vivantes, et tout ça grâce à une technologie appelée Expansion du Code Génétique.

#Les Bases de l'Expansion du Code Génétique

Alors, comment ça marche tout ça ? Imagine que t'as une recette qui ne permet qu'un nombre limité d'ingrédients. L'expansion du code génétique, c'est un peu comme ajouter des ingrédients nouveaux et stylés à la recette. Pour que ça marche, les scientifiques ont besoin d'une paire d'aides spéciales : une aminoacyl-tRNA synthétase (aaRS) et un tRNA qui ne traînent pas d'habitude avec la foule cellulaire habituelle. Cette paire spéciale peut reconnaître et ajouter les ncAAs souhaités aux protéines quand le bon signal (un codon inutile transformé) apparaît.

#Trouver la Bonne Paire

Pour s'assurer que la nouvelle paire ne se mélange pas avec celles qui sont déjà dans la cellule, les scientifiques empruntent souvent ces outils à différents types d'organismes, comme les bactéries, les archées ou les eucaryotes. Ça veut dire que quand on fait ça dans des bactéries, on peut prendre l'aaRS des archées ou des eucaryotes, et vice versa. C'est un peu comme rassembler des ingrédients de différentes parties du monde pour concocter un plat unique !

#Élargir l'Utilisation de la Technologie GCE

Cette technologie a évolué pour fonctionner dans les cellules eucaryotes, y compris les cellules de mammifères. Ça a ouvert de nouvelles possibilités passionnantes pour étudier comment fonctionnent les cellules et pour créer de nouveaux biothérapeutiques. Plusieurs paires aaRS/tRNA ont été modifiées pour permettre l'incorporation de différents ncAAs dans les protéines chez les eucaryotes. Certaines de ces paires viennent d’E. coli, d’archées, et même de mélanges personnalisés appelés paires chimériques.

Bien que beaucoup de ncAAs aient été introduits dans des cellules eucaryotes, la plupart des succès viennent d'une paire en particulier (les paires pyrrolysyles). La raison, c'est que la synthétase pyrrolysyle est assez flexible et peut être ajustée facilement avec des méthodes simples disponibles dans E. coli. Mais les scientifiques ont besoin d'accéder à plus de paires ingénieries pour augmenter la variété des ncAAs qu'ils peuvent utiliser.

#La Paire Écologique Leucyl-tRNA Synthetase

Un acteur prometteur dans le jeu est la paire de leucyl-tRNA synthétase (EcLeuRS)/tRNA d’E. coli. Depuis plus de 20 ans, EcLeuRS a été adaptée pour ajouter un petit mais divers ensemble de ncAAs. Même si elle a fait des progrès, elle reste derrière sa contrepartie pyrrolysyle en ce qui concerne le nombre de ncAAs utilisables. Un petit souci dans le processus, c'est que les méthodes utilisées pour modifier EcLeuRS dans les levures n'ont pas été les meilleures.

Pour améliorer les choses, les chercheurs ont développé deux systèmes basés sur des levures pour sélectionner des mutants EcLeuRS utiles. Le premier est une sélection basée sur la survie qui utilise une version cassée d'un activateur transcriptionnel, et le second utilise une méthode de tri fluorescent appelée FACS. Le système basé sur la survie a été plus populaire car il permet de tester des groupes plus grands de mutants en moins de temps.

#Améliorer le Système de Sélection

Cependant, le système de sélection basé sur la survie existant pour EcLeuRS peut avoir des problèmes. Par exemple, il laisse parfois survivre les mauvais mutants à cause d'un petit gremlin appelé "expression fuite". Après quelques expériences, les chercheurs ont découvert qu'ils pouvaient renforcer la rigueur de la sélection en ajoutant un autre codon stop dans le gène du facteur de transcription. Ça veut dire que seuls les mutants qui font vraiment le job seraient sélectionnés.

En faisant ces ajustements, les chercheurs ont réussi à trouver efficacement de nouveaux mutants EcLeuRS capables d'accepter divers ncAAs, conduisant à une belle augmentation de leur boîte à outils de ncAA. Ils se sont concentrés sur trois ncAAs prominents comme l'acide 2-aminocaprylique, ONBC (un dérivé de citrulline photocagé), et Kacme (une nouvelle modification pour les modifications post-traductionnelles de la lysine).

#Évolution Dirigée pour Meilleure EcLeuRS

Avec le nouveau système de sélection en place, les scientifiques sont impatients de modifier encore plus EcLeuRS. Ils ont créé une bibliothèque de mutants en changeant des parties spécifiques de la structure d'EcLeuRS. Ça veut dire qu'ils ont pu trouver des mutants capables de reconnaître et d'incorporer spécifiquement les nouveaux ncAAs. Après quelques tours de sélection, ils ont pu identifier plusieurs mutants réussis.

Ils ont aussi rencontré un problème de "triche", où certains clones n'encode pas les mutations nécessaires mais survivent quand même à la sélection. Pour résoudre ça, au lieu de réutiliser les mêmes cellules de levure pour chaque tour de sélection, ils ont isolé l'ADN prometteur et l'ont introduit dans des cellules fraîches. Ça a mené à de bien meilleurs résultats et aidé à éliminer les tricheurs.

#La Quête pour une Incorporation Efficace des ncAA

Après avoir confirmé la fonctionnalité de leur système de sélection amélioré, les chercheurs ont décidé de se concentrer sur la création de mutants EcLeuRS capables d'incorporer efficacement ONBC. Cet ncAA est important pour ajouter une modification spécifique (citrulline) qui peut influencer la performance des protéines. En faisant leur processus de sélection, ils ont trouvé plusieurs clones capables d'utiliser ONBC et de produire les protéines désirées.

Dans une autre expérience, ils cherchaient à introduire Kacme dans les protéines - cette modification a été liée à la régulation de l'expression des gènes. Les scientifiques devaient créer un mutant EcLeuRS spécial pour accomplir cette tâche, ce qu'ils ont fait grâce à leur système de sélection optimisé. Ils ont testé l’efficacité de ces nouvelles variantes, et beaucoup ont montré d'excellents résultats dans des cellules de mammifères.

#Polyspecivité : Une Surprise Spectaculaire

Fait intéressant, ils ont découvert que certains de leurs nouveaux mutants EcLeuRS étaient "super-polyspecifiques", leur permettant d'incorporer une large gamme de ncAAs. C'était plutôt inattendu, car il semblait qu'ils pouvaient charger divers acides aminés inhabituels sans modifications supplémentaires. Ils ont débloqué le potentiel d'inclure différentes fonctionnalités dans les protéines sans repartir de zéro.

Pour te donner une idée, certains de ces mutants permettent d'incorporer des étiquettes ou des modifications spéciales qui peuvent aider les scientifiques à suivre les protéines ou à mieux comprendre comment elles fonctionnent. C'est comme avoir un couteau suisse pour les modifications des acides aminés - plein d'outils pour différents travaux !

#L'Importance de l'Ornithine

L'ornithine, un acide aminé non canonique, a des applications naturelles dans les protéines et peut être particulièrement utile pour étudier les peptides bioactifs. Cependant, l'incorporer directement peut être compliqué à cause de l'instabilité dans l'appariement habituel acide aminé-tRNA. Pour résoudre ce problème, les chercheurs ont créé une version photocagée appelée ONBO, qui peut être incorporée facilement et activée par la lumière.

Ils étaient ravis quand un de leurs nouveaux mutants EcLeuRS, B11, a pu incorporer facilement ONBO dans les protéines. Lorsqu'il est exposé à la lumière, il libère de l'ornithine, ouvrant une nouvelle voie pour des études biochimiques.

#Conclusion

L'avancement des technologies permettant d'ajouter des acides aminés non canonicals aux protéines a ouvert la voie à de nouvelles découvertes en biologie moléculaire. En optimisant les méthodes de sélection et en ingénierie des mutants EcLeuRS efficaces, les chercheurs ont considérablement étendu leur boîte à outils. Alors qu'ils continuent d'explorer ce domaine, les possibilités d'utilisation de ces acides aminés novateurs en recherche et en médecine commencent à peine à se dévoiler.

Considère cela comme un voyage culinaire où les chefs (scientifiques) continuent d'améliorer leurs recettes (méthodes) pour concocter des plats plus diversifiés et passionnants (protéines) qui pourraient changer notre façon de traiter les maladies ou de comprendre les processus cellulaires à l'avenir. Alors, la prochaine fois que tu penses aux protéines, souviens-toi qu'il y a tout un monde d'ingrédients non conventionnels qui n'attendent qu'à être explorés !