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# Biologie # Microbiologie

Nouvelle méthode de test pour la fièvre porcine africaine

Un outil prometteur pour détecter rapidement la PPA chez les cochons est en cours de développement.

Sekhar Kambakam, Julia Thomas, Suelee Robbe-Austerman, Karthik Shanmuganatham, Rachel Palinski

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Méthode de détection de Méthode de détection de l'ASF plus rapide des résultats rapides. Nouveau test combine RPA et CRISPR pour
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La fièvre porcine africaine (FPA) est une maladie virale qui touche les cochons, qu'ils soient domestiques ou sauvages. Cette maladie est causée par un virus connu sous le nom de Virus de la fièvre porcine africaine (VPPA). Il fait partie d’un groupe de virus connus pour leur structure complexe. Le VPPA contient beaucoup de matériel génétique, en gros de l'ADN double brin, et il peut produire plus de 160 protéines différentes qui l’aident à fonctionner.

La FPA est réputée pour être super contagieuse. Ça veut dire que si un cochon est infecté, ça peut vite se propager aux autres, ce qui crée des gros problèmes pour les éleveurs de porcs. Le VPPA peut se transmettre de cochon à cochon par contact direct, mais il peut aussi survivre longtemps en dehors des cochons. Il peut traîner dans l'environnement, dans la nourriture, sur les équipements ou même sur les vêtements. À cause de ça, le virus pose de sérieux soucis à l'industrie du porc à l'échelle mondiale.

Les cochons infectés peuvent présenter différents symptômes. Ils développent souvent une forte fièvre et peuvent devenir léthargiques, perdre l'appétit, vomir, avoir la diarrhée, et même souffrir de saignements et de difficultés respiratoires. Dans les cas graves, les cochons peuvent mourir rapidement, parfois en une semaine, et le taux de mortalité peut atteindre jusqu'à 100 %.

Origines et propagation de la FPA

On pense que la FPA a commencé en Afrique subsaharienne, où le virus est toujours présent parmi les populations de cochons locales. Au fil des ans, il y a eu des éclosions en Europe et en Amérique, même si beaucoup d'entre elles ont été contrôlées ensuite.

Un gros foyer s'est produit en Géorgie en 2007, ce qui a conduit le virus à se répandre largement parmi les populations de sangliers en Europe de l'Est. Pendant plus d'une décennie, la FPA est restée assez contenue jusqu'à ce que des mesures de biosécurité soient enfreintes, permettant au virus de se propager rapidement en Chine en 2018. Cette éclosion a eu des effets dramatiques, provoquant l'effondrement de l'industrie porcine du pays.

En 2021, le virus a été détecté sur l'île caribéenne d'Hispaniola, et cette éclosion est toujours en cours, ce qui soulève des inquiétudes pour des pays comme les États-Unis. Pour lutter contre cette menace, les États-Unis ont intensifié leurs efforts pour surveiller et contrôler la FPA. Ils ont mis en place des mesures strictes pour empêcher le mouvement de porc et de produits connexes des territoires touchés, espérant protéger leur population porcine domestique.

Le besoin d'un diagnostic efficace

Étant donné l'impact grave de la FPA, une détection rapide et précise est vitale. Les méthodes traditionnelles comme le QPCR (qui signifie réaction de polymérase en chaîne quantitative) sont actuellement le standard en matière de diagnostic du VPPA. Cependant, le qPCR nécessite un équipement coûteux, une formation spéciale et des installations spécifiques, ce qui le rend impraticable pour les zones à ressources limitées.

Des méthodes alternatives comme RPA (amplification par polymérase recombinante) et LAMP (amplification isotherme médiée par boucle) ont été développées mais n'atteignent pas la précision du qPCR. C'est un peu comme essayer d'attraper un animal rapide avec un filet plus lent. Le défi est de créer des tests aussi bons que le qPCR, mais assez simples à utiliser pour tout le monde, même dans des zones reculées.

Une approche innovante : la technologie CRISPR

Récemment, une nouvelle technique appelée CRISPR a fait parler d'elle dans de nombreux domaines, y compris le génie génétique et la médecine. Cette technologie a le potentiel d'être adaptée au diagnostic des maladies, y compris la FPA.

En combinant CRISPR avec RPA, les chercheurs essaient de développer des tests plus rapides et plus simples qui peuvent être utilisés directement sur le terrain où sont gardés les cochons. Cette approche duale pourrait aider les éleveurs à identifier rapidement les infections et à prévenir des éclosions plus importantes.

Développement d'une nouvelle méthode de test

Dans cette recherche, les scientifiques se sont concentrés sur la création d'un nouveau test pour le VPPA en utilisant RPA associé à la technologie CRISPR. D'abord, ils ont sélectionné de petits morceaux d'ARN conçus pour cibler le VPPA. Cela a impliqué de tester l’efficacité de ces morceaux pour reconnaître le virus.

Après avoir confirmé que le nouveau test pouvait identifier le VPPA avec précision, ils ont veillé à ce qu'il fonctionne bien avec divers échantillons, des écouvillons sanguins à d'autres matériaux biologiques. La nouvelle méthode visait à fournir des résultats correspondant à ceux obtenus par des tests qPCR traditionnels, confirmant ainsi sa fiabilité.

Comment fonctionne le nouveau test

Le test développé est un processus simple en deux étapes. Dans la première étape, RPA amplifie le matériel génétique du virus s'il est présent dans l'échantillon. Cette étape se déroule à température constante, ce qui facilite la gestion.

Une fois le matériel génétique amplifié, le CRISPR entre en jeu. Le système CRISPR reconnaît et marque le matériel viral amplifié et émet un signal fluorescent. Si le test fonctionne, la zone de test s'illumine, un peu comme une ampoule qui s'allume quand tu actionnes l'interrupteur. Ce signal visuel est super utile, car il permet des vérifications rapides sans avoir besoin d'installations de laboratoire complexes.

Test de la nouvelle méthode

Pour s'assurer que le nouveau test fonctionne correctement, les chercheurs ont réalisé des essais approfondis. Ils ont préparé des échantillons de contrôle positifs contenant de l'ADN du VPPA et les ont testés avec des échantillons d'autres virus pour confirmer que la nouvelle méthode ne confondait pas d'autres infections virales avec la FPA.

Les chercheurs ont aussi évalué comment la méthode fonctionnait dans différentes conditions, en utilisant différents types d'échantillons que les cochons pourraient avoir. Ils ont même ajouté des concentrations connues d'ADN du VPPA pour voir si le test pouvait les détecter de manière fiable, ce qui a été le cas.

Évaluation de l'efficacité

Dans ces essais, la nouvelle méthode a montré de solides performances. Le test pouvait identifier avec précision le VPPA tant dans des conditions contrôlées que sur de vrais échantillons prélevés sur des cochons suspectés d'être infectés. Les résultats ont montré un niveau impressionnant de fiabilité, correspondant aux constats du qPCR, et soulignant à quel point cette méthode pourrait être utile sur le terrain.

Pourquoi c'est important

Le développement de ce nouveau test est crucial car il fournit un outil essentiel pour les éleveurs et les vétérinaires. En cas d'éclosion de FPA, un test rapide et fiable peut aider à la détection précoce et au contrôle. Un diagnostic rapide signifie des actions plus rapides pour prévenir la propagation du virus.

Cette innovation peut être particulièrement bénéfique dans des zones où les ressources et l'accès aux installations de laboratoire sont limités. En donnant les moyens à ceux qui sont en première ligne de l'élevage porcin, ce test pourrait aider à protéger l'industrie des effets dévastateurs de la FPA.

Conclusion

En résumé, la montée de la FPA représente un défi de taille pour l'élevage porcin à l'échelle mondiale, affectant l'approvisionnement alimentaire et la stabilité économique. Le développement d'une méthode de test simple et efficace qui combine RPA et CRISPR pourrait changer notre approche de cette maladie.

Avec un outil rapide et précis pour diagnostiquer la FPA, on pourrait voir une diminution des éclosions et un risque réduit pour les populations porcines. Parfois, il faut un brin de créativité et d'innovation—comme mélanger la science avec une touche d'humour—pour surmonter les défis. Les scientifiques travaillent sans relâche pour courber la courbe de la propagation des maladies, rendant le monde plus sûr pour nos amis à quatre pattes et les agriculteurs qui s'occupent d'eux.

Source originale

Titre: Rapid identification of African swine fever virus in diagnostic samples using CRISPR-Cas

Résumé: African Swine Fever Virus (ASFV) is a high consequence, highly transmissible pathogen affecting swine causing African Swine Fever (ASF), a devastating disease, with high mortality rates in naive populations. Due to the likelihood of significant economic impacts associated with an ASF outbreak, considerable resources have been allocated in the United States (U.S.) to safeguard the swine industry against this threat. Ongoing outbreaks of ASF in the Dominican Republic and Haiti further threaten U.S. swine due to their proximity and involvement in movement to and from North America. While surveillance programs are ongoing, there are limited point-of-care (POC) tests available during outbreaks that maintain the sensitivity and specificity standards of laboratory testing (e.g., qPCR). However, the recently developed CRISPR-Cas testing systems may provide comparable high-quality results. In a CRISPR-based diagnostic assay, CRISPR effectors can be programmed with CRISPR-RNA (crRNA) to target specific DNA or RNA. Upon target binding, the Cas enzyme undergoes collateral cleavage of nearby fluorescently quenched reporter molecules (ssDNA or ssRNA), which can be detected under blue light or a fluorescence microplate reader. Furthermore, this tool is rapid, simple, cost-effective and can be performed with inexpensive equipment. For these reasons, we sought to develop a low-cost visual detection method for ASFV by employing the recombinase polymerase amplification (RPA)-dependent CRISPR-Cas12a technique that can be utilized in the field as a point-of-care-assay. Our CRISPR-Cas12a assay demonstrated comparable sensitivity and specificity to qPCR, both visually and when quantified using a fluorescent reader. In whole blood samples from ASFV-suspect or ASFV-negative cases, the CRISPR assay achieved a sensitivity of 98.3% (102 DNA copies) and a specificity of 100%. Finally, an assessment of the reaction time constraints indicated that results can be visualized in as little as seven minutes with a peak fluorescence at 40 min (RPA and CRISPR steps). The results of this feasibility assay validation allow for the rapid development of sensitive and specific POC tests that may be used for outbreak response in the future.

Auteurs: Sekhar Kambakam, Julia Thomas, Suelee Robbe-Austerman, Karthik Shanmuganatham, Rachel Palinski

Dernière mise à jour: 2024-12-30 00:00:00

Langue: English

Source URL: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.12.27.630508

Source PDF: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.12.27.630508.full.pdf

Licence: https://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/

Changements: Ce résumé a été créé avec l'aide de l'IA et peut contenir des inexactitudes. Pour obtenir des informations précises, veuillez vous référer aux documents sources originaux dont les liens figurent ici.

Merci à biorxiv pour l'utilisation de son interopérabilité en libre accès.

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