Mapeo de interacciones proteína-metabolito en E. coli

Las redes de Interacción proteína-metabolito (PMI) son sistemas complejos que no se han estudiado a fondo, incluso en organismos modelo simples. Los Metabolitos son moléculas pequeñas que pueden regular varias actividades de las proteínas, incluyendo cómo interactúan con otras proteínas, dónde se localizan dentro de una célula y sus estados condensados. Entender estas interacciones es importante porque juegan un papel crucial en las funciones celulares. Por ejemplo, estudios han mostrado que alrededor del 75% de los factores de transcripción en Escherichia coli tienen partes que pueden unirse a moléculas pequeñas. Las redes PMI son dinámicas y pueden cambiar rápidamente en respuesta a diferentes señales ambientales o de desarrollo.

Investigaciones recientes han demostrado que una sola proteína puede interactuar con varios metabolitos pequeños, lo que puede ayudar a identificar nuevas conexiones regulatorias. Hay métodos bioquímicos tradicionales para identificar estas interacciones, desde usar proteínas o metabolitos específicos como cebos hasta técnicas más nuevas que miden cambios en las propiedades de las proteínas cuando se unen moléculas pequeñas. Sin embargo, estos métodos tienen limitaciones, especialmente porque dependen de tener la proteína o metabolito adecuado disponible.

Para enfrentar estos desafíos, los científicos desarrollaron un método llamado PROMIS, que significa Interacciones PROteína-Metabolito usando separación de tamaño. Este método utiliza una técnica llamada espectrometría de masas por co-fraccionamiento (CF-MS) para cartografiar complejos proteína-metabolito sin necesidad de cebos específicos. El enfoque de CF-MS combina la separación de complejos de proteínas enteras con un análisis detallado de su contenido. Ha sido útil para construir redes de interacción comprensivas a través de varios organismos.

En el método original de PROMIS, diferentes componentes en una muestra se separan según su tamaño. Los metabolitos que están ligados a complejos de proteínas tienden a eluirse antes que las moléculas pequeñas no unidas. Esto permite a los investigadores identificar qué metabolitos están interactuando con proteínas. Sin embargo, en estos experimentos, un solo metabolito a menudo puede co-fraccionarse con muchas proteínas, lo que dificulta determinar cuáles son interacciones reales.

Para mejorar la precisión en la identificación de estas interacciones reales, los investigadores sugirieron combinar dos métodos cromatográficos diferentes: cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) y cromatografía de intercambio iónico (IEX). La idea es que las proteínas que son similares en tamaño pueden diferir en carga, facilitando distinguir entre uniones verdaderas y co-eluciones coincidentes. Métodos anteriores han mostrado que usar dos tecnologías de cromatografía diferentes puede llevar a una mejor separación e identificación de estas interacciones.

#El Enfoque Experimental

Para probar esta hipótesis, los investigadores se enfocaron en E. coli porque tiene un conjunto más simple de proteínas y metabolitos, lo que facilita el estudio. La integración de PROMIS e IEX ayudaría idealmente a aclarar las interacciones entre proteínas y metabolitos.

El primer paso consistió en cultivar E. coli en un ambiente controlado hasta que alcanzaron una fase de crecimiento específica. Luego se recolectaron las células y se procesaron para extraer proteínas y metabolitos. Usando cromatografía de exclusión de tamaño, los investigadores separaron proteínas y metabolitos según su tamaño. Este paso generó varias fracciones que contenían proteínas y metabolitos, que luego se analizaron más a fondo utilizando técnicas de espectrometría de masas.

Se aplicó IEX a las mismas muestras para crear un conjunto diferente de fracciones. En este proceso, también se preparó una muestra de control, donde el lisado se calentó para desnaturalizar las proteínas. Al comparar los perfiles de elución de la muestra y el control, los investigadores pudieron identificar mejor qué metabolitos probablemente estaban ligados a proteínas.

El objetivo era construir una red PMI comprensiva encontrando pares de proteínas y metabolitos que co-eluyen en ambas separaciones SEC e IEX a través de varias repeticiones del experimento. Un hallazgo significativo de este trabajo fue que ciertos metabolitos co-ocurrían con proteínas específicas en todos los conjuntos de datos, indicando una probable interacción.

#Mapeo del Interactoma

Para crear una imagen completa de la red PMI en E. coli, los investigadores analizaron todos los pares de metabolitos-proteínas identificados, buscando interacciones consistentes a través de múltiples experimentos. Encontraron una gran cantidad de conexiones, mostrando una red compleja de interacciones.

Los análisis proteómicos y metabolómicos revelaron muchas proteínas y metabolitos, incluyendo intermediarios metabólicos importantes, aminoácidos y otros compuestos. Los resultados generales mostraron que IEX podría separar eficazmente los complejos proteína-metabolito en medio de una mezcla compleja de contenidos celulares.

El análisis funcional de las proteínas identificadas indicó que muchas de ellas están involucradas en funciones celulares esenciales, particularmente en el metabolismo. Por ejemplo, se esperaban interacciones entre monofosfatos de nucleótidos y ribosomas debido a sus roles en la traducción.

Los resultados también revelaron que diferentes clases de metabolitos interactuaban con conjuntos distintos de proteínas. Se mostró que los aminoácidos interactúan con enzimas involucradas en la biosíntesis de aminoácidos, mientras que los dipeptidos-cadenas cortas de aminoácidos-tenían su propio conjunto único de interacciones, muchas relacionadas con el estado del nitrógeno y el metabolismo de proteínas.

#Interacciones Nuevas y Sus Implicaciones

Dentro de la extensa lista de interacciones, algunas destacaron como particularmente interesantes y pueden ofrecer información sobre nuevos mecanismos regulatorios. Por ejemplo, las interacciones que involucran dipeptidos y enzimas relacionadas con el metabolismo de lípidos sugieren un posible papel regulador para estas moléculas pequeñas al conectar la degradación de proteínas con la síntesis de lípidos.

Un ejemplo específico de interés fue la interacción entre un dipeptido llamado Val-Leu y una enzima llamada FabF, esencial para la elongación de ácidos grasos. Usando otro método llamado termoforese a microescala, los investigadores confirmaron que Val-Leu realmente se une a FabF, lo que podría influir en cómo se producen los ácidos grasos.

También encontraron un compuesto llamado lumicromo, un derivado de la riboflavina, presente en su red PMI de E. coli. El lumicromo mostró interacciones potenciales con varias proteínas, incluyendo una involucrada en la síntesis de nucleótidos de pirimidina. Al comparar con estudios previos de otros organismos, los investigadores identificaron que algunas de las proteínas que interactuaban con lumicromo estaban conservadas entre especies.

Al evaluar el efecto de la unión de lumicromo en la enzima PyrE, observaron que lumicromo inhibía la actividad de PyrE. Esta inhibición podría influir en la producción de compuestos necesarios para la formación de biopelículas en bacterias, sugiriendo un posible papel para lumicromo en la gestión de la dinámica de biopelículas.

#Perspectivas Futuras

A través de los métodos combinados de SEC e IEX, se logró un mapeo más preciso de la red PMI. Esta técnica de dos partes proporciona una comprensión más detallada de cómo interactúan las proteínas y los metabolitos, permitiendo una mejor identificación de emparejamientos nuevos que podrían haber pasado desapercibidos anteriormente.

Los hallazgos muestran que ciertas interacciones de metabolitos podrían tener impactos significativos en procesos biológicos, incluyendo el metabolismo y la formación de biopelículas. Estudios futuros podrían explorar más a fondo estas interacciones para entender su significado biológico y roles en la regulación celular.

Además, se necesitan más investigaciones para comprender completamente cómo estas interacciones influyen en el comportamiento celular bajo diversas condiciones. Al validar las interacciones identificadas a través de estudios adicionales y métodos experimentales, los investigadores buscan descubrir conocimientos más profundos sobre las complejidades del metabolismo celular.

En conclusión, este trabajo resalta la importancia de combinar diferentes técnicas para estudiar las interacciones proteína-metabolito. Los hallazgos pueden allanar el camino para más investigaciones sobre cómo estas interacciones desempeñan roles esenciales en la regulación de procesos fundamentales en las células, con implicaciones para entender el comportamiento bacteriano, el metabolismo y potencialmente desarrollar nuevos enfoques terapéuticos.