Nuevas perspectivas sobre el ciclo de vida de Leishmania
La investigación arroja luz sobre el ciclo celular de Leishmania usando técnicas de imagen avanzadas.
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Tabla de contenidos
Leishmania son organismos diminutos que pueden causar enfermedades graves tanto en humanos como en animales. Estos organismos pueden provocar varios problemas de salud, incluyendo llagas en la piel que pueden dejar cicatrices y condiciones internas más severas que pueden ser mortales. Hay muchos tipos de Leishmania, y se propagan a través de las picaduras de ciertos tipos de moscas llamadas moscas de arena.
Uno de los aspectos más importantes de cómo estos parásitos causan enfermedades es su ciclo de vida. Para completar su ciclo de vida de manera efectiva y enfermar a las personas, Leishmania necesita reproducirse dentro de sus huéspedes. Por eso, los científicos están tratando de aprender más sobre cómo funciona el ciclo de crecimiento de estos parásitos a un nivel detallado. Comprender esto podría ayudar a encontrar nuevos tratamientos para las enfermedades causadas por Leishmania.
La Estructura de Leishmania
Leishmania pertenece a un grupo más grande de organismos conocidos como Kinetoplastida. Una de las características únicas de estos organismos es que tienen dos estructuras celulares que contienen ADN: el núcleo y el kinetoplasto. El kinetoplasto está vinculado a estructuras importantes que ayudan al parásito a moverse, llamadas flagelos. El flagelo sale de una parte especial de la célula llamada bolsillo flagelar, que también es la zona donde la célula absorbe y libera materiales.
Además de estas estructuras, Leishmania tiene un componente celular pequeño llamado aparato de Golgi, que ayuda en el procesamiento y transporte de proteínas. La forma de la célula y la disposición de estas estructuras cambian a medida que la célula avanza en su ciclo. Entender estos cambios es esencial ya que están conectados a cómo Leishmania se reproduce y se desarrolla.
El Ciclo celular de Leishmania
El ciclo celular de Leishmania se divide en varias fases. Al principio del ciclo, conocido como la fase G1, la célula tiene un núcleo, un kinetoplasto y un flagelo. A medida que la célula avanza en la fase G1, crece en longitud. Una vez que termina la fase G1, la célula entra en la fase S, durante la cual duplica su ADN. Los cambios en la forma de la célula durante esta fase son significativos.
Después de la fase S, la célula entra en lo que se cree que es una fase G2 muy corta. Luego, la célula pasa por mitosis, donde se divide en dos nuevas células. Durante la mitosis, las células pueden cambiar de forma nuevamente, volviéndose más cortas y anchas.
Diferentes estudios han informado diversas secuencias sobre cuándo se divide el núcleo y el kinetoplasto. Algunos estudios sugieren que el núcleo suele dividirse antes que el kinetoplasto, mientras que otros indican lo contrario. Técnicas de imagen recientes han revelado que, en algunos casos, la última conexión entre los núcleos hijos se corta solo después de que el kinetoplasto se ha dividido.
Una vez que el proceso de división se completa, el último paso del ciclo celular se llama citocinesis. Aquí es donde la célula se divide en dos células separadas. El proceso implica cambios en la estructura del citoesqueleto, un marco que ayuda a mantener la forma de la célula.
Midiendo el Ciclo Celular
Para entender cómo Leishmania avanza a través de este ciclo, los científicos suelen usar diferentes métodos para observar y medir las estructuras celulares. Pueden usar técnicas de tinción especiales para resaltar las estructuras dentro de las células, junto con técnicas visuales para medir los tamaños celulares. Sin embargo, estos métodos pueden ser intensivos en mano de obra y presentan desafíos. Por ejemplo, mientras que la microscopía puede ofrecer imágenes detalladas, puede ser un proceso que consume mucho tiempo, especialmente al tratar con grandes poblaciones de células.
Por otro lado, los métodos de citometría de flujo pueden procesar muchas células a la vez, pero no proporcionan imágenes detalladas ni información sobre la disposición de las estructuras dentro de las células. Así, los investigadores han estado buscando nuevas tecnologías para analizar mejor el ciclo celular de Leishmania.
Citometría de flujo por imagen: Un Nuevo Enfoque
La citometría de flujo por imagen (IFC) representa un método nuevo y prometedor para analizar células. Esta tecnología combina la capacidad de procesamiento rápido de la citometría de flujo con las capacidades de imagen detallada de la microscopía. Puede tomar imágenes de alta resolución de incontables células en poco tiempo. Esto significa que los investigadores pueden recopilar muchos datos y analizar varias propiedades de células individuales al mismo tiempo.
La IFC permite a los científicos capturar imágenes en diferentes modos, lo que ayuda a analizar varias características de las células, como su longitud y ancho. La tecnología permite definir poblaciones celulares específicas en función de la morfología y el contenido de ADN. Incluso puede clasificar automáticamente las células en diferentes etapas del ciclo celular.
Estudiando el Ciclo Celular de Leishmania con Citometría de Flujo por Imagen
Para ver si la IFC podría ser útil para estudiar el ciclo celular de Leishmania, los investigadores examinaron células vivas y células fijadas. Descubrieron que al analizar las imágenes de las células, era posible ver distintas etapas del ciclo celular y validar que los cambios en la morfología dependientes del ciclo celular eran observables tanto en poblaciones vivas como fijadas.
Notablemente, al usar tintes para el ADN, un tinte en particular, el Vybrant DyeCycle Orange (DCO), se encontró que teñía el ADN cuantitativamente en células vivas. Esto permitió a los investigadores rastrear el contenido de ADN y estimar eficazmente la etapa del ciclo celular para células individuales.
Resultados del Estudio
Usando IFC y DCO, los investigadores pudieron distinguir diferentes etapas del ciclo celular en Leishmania. Pudieron diferenciar entre células de G1 temprana y tardía, células en fase S, y aquellas en fases G2/M. Al rastrear la expresión y localización de una proteína llamada KINF, etiquetada con un marcador fluorescente, también pudieron ver cuándo ocurrían cambios específicos durante el ciclo celular.
Esto llevó a la identificación del tiempo para diferentes etapas del ciclo celular. Los investigadores encontraron que la fase G1 duraba un tiempo considerable, con la fase S siendo más larga de lo que se pensaba anteriormente, mientras que la fase G2 era relativamente corta.
Importancia de los Hallazgos
Estos hallazgos representan un gran avance en la comprensión del ciclo celular de Leishmania. La capacidad de categorizar células según su morfología y contenido de ADN proporciona a los investigadores nuevas herramientas para investigar cómo estos parásitos crecen y se dividen. Esta información podría ser crucial para desarrollar nuevos tratamientos contra las enfermedades causadas por Leishmania.
Las nuevas herramientas y métodos aquí demostrados podrían aplicarse no solo a Leishmania, sino también para estudiar otros parásitos y sus ciclos celulares.
Conclusión
El estudio de Leishmania y su ciclo de vida es vital debido a las enfermedades que causan. Entender su ciclo celular puede revelar nuevos caminos para soluciones terapéuticas. La citometría de flujo por imagen ha demostrado ser un método efectivo para identificar y analizar las etapas del ciclo celular de Leishmania, lo que puede ayudar a avanzar significativamente en la investigación en este campo. Esta tecnología ofrece a los científicos la oportunidad de estudiar la biología de estos parásitos a un nivel sin precedentes, con el potencial de descubrimientos impactantes en los próximos años.
Título: Analysis of the Leishmania mexicana promastigote cell cycle using imaging flow cytometry provides new insights into cell cycle flexibility and events of short duration.
Resumen: Promastigote Leishmania mexicana have a complex cell division cycle characterised by the ordered replication of several single-copy organelles, a prolonged S phase and rapid G2 and cytokinesis phases, accompanied by cell cycle stage-associated morphological changes. Here we exploit these morphological changes to develop a high-throughput and semi-automated imaging flow cytometry (IFC) pipeline to analyse the cell cycle of L. mexicana in live cells. Firstly, we demonstrate that, unlike several other DNA stains, Vybrant DyeCycle Orange (DCO) is non-toxic and enables quantitative DNA imaging in live L. mexicana promastigotes. Secondly, by tagging the orphan spindle kinesin, KINF, with mNeonGreen, we describe KINFs cell cycle-dependent expression and localisation. Then, by combining manual gating of DCO DNA intensity profiles with automated masking and morphological measurements of parasite images, visual determination of the number of flagella per cell, and automated masking and analysis of mNG:KINF fluorescence, we provide a newly detailed description of L. mexicana promastigote cell cycle events that, for the first time, includes the durations of individual G2, mitosis and post-mitosis phases, and identifies G1 cells within the first 12 minutes of the new cell cycle. By applying IFC in this way, we were able, in minutes, to capture tens of thousands of high-quality brightfield and fluorescent images of live L. mexicana cells in solution, and to acquire quantitative data across multiple parameters for every image captured. Our custom-developed masking and gating scheme allowed us to identify elusive G2 cells and to demonstrate that the CDK-inhibitor, flavopiridol, arrests cells in G2 phase, rather than mitosis, providing proof-of-principle of the utility of IFC for drug mechanism-of-action studies. Further, the high-throughput nature of IFC allowed the close examination of promastigote cytokinesis, revealing considerable flexibility in both the timing of cytokinesis initiation and the direction of furrowing, in contrast to the related kinetoplastid parasite, Trypanosoma brucei. Significantly, our analysis demonstrate that the cleavage furrow can ingress unidirectionally from either pole of the cell, bidirectionally from both simultaneously or even commence internally along the anterior-posterior (A-P) axis. Our new pipeline offers many advantages over traditional methods of cell cycle analysis such as fluorescence microscopy and flow cytometry and paves the way for novel high-throughput analysis of Leishmania cell division. Author SummaryLeishmania mexicana is a single-celled parasite that is spread by sand flies and causes a spectrum of diseases called the leishmaniases in humans and animals. To cause disease, L. mexicana parasites must replicate and divide, and their cell division cycle has unusual and/or complex features, including that the parasite changes shape as it replicates. To aid analysis of the L. mexicana cell cycle, we developed a new quantitative DNA staining technique and also generated a fluorescent parasite cell line that highlighted when cells were dividing their DNA (mitosis) after replicating it. We then applied a high-throughput technique called imaging flow cytometry to capture images of tens of thousands of these parasites in just a few minutes. For each image, we were able to extract data about DNA replication, cell shape, whether the cells were in mitosis or not and how they divide. This provided new insights into how the parasites replicate and how long each stage of cell division takes as well as how the parasites split in two at the end of cell division. We were also able to use our analysis method to precisely determine the cell cycle stage at which a cell cycle inhibitor acts. More importantly, the imaging pipelines we have developed offer great advantages in terms of speed and depth over more traditional analysis techniques such as microscopy and should pave the way for increasingly detailed analyses of parasite cell biology in the future.
Autores: Tansy C Hammarton, J. Howell, S. Omwenga, M. Jimenez
Última actualización: 2024-04-16 00:00:00
Idioma: English
Fuente URL: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.07.24.550259
Fuente PDF: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.07.24.550259.full.pdf
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