Avances en la producción de vacunas de ARNm

En los últimos años, un nuevo tipo de droga basada en mRNA ha llamado mucho la atención, especialmente las vacunas de mRNA. Estas vacunas son un enfoque fresco para protegerse contra enfermedades y han mostrado potencial en el tratamiento de varias condiciones. A diferencia de las vacunas tradicionales, las vacunas de mRNA tienen beneficios únicos que las hacen atractivas.

Un gran beneficio es que las vacunas de mRNA se pueden diseñar y hacer rápido. Esto es porque no dependen de las secuencias genéticas específicas de los virus contra los que protegen. Así, los científicos pueden desarrollar y producir estas vacunas más rápido y más barato que los tipos de vacunas más viejos.

Además, las vacunas de mRNA pueden activar el sistema inmunológico para producir moléculas importantes, llamadas Citoquinas, que ayudan a combatir infecciones. Esto significa que pueden entrenar al cuerpo para responder de forma más efectiva sin necesitar sustancias extras, conocidas como adyuvantes, que a menudo se usan en vacunas tradicionales.

#Proceso de Producción de mRNA

Para llevar las vacunas de mRNA a su uso en el mundo real, se necesitan varios pasos en el proceso de producción. Primero, los científicos crean el mRNA mismo. Esto implica comenzar con una plantilla de ADN y usar una enzima llamada ARN polimerasa para crear el mRNA a través de un proceso llamado transcripción. El mRNA resultante consta de varias secciones clave, incluyendo la parte que hará la proteína objetivo, y áreas específicas en ambos extremos que ayudan con la estabilidad.

Una vez producido el mRNA, necesita ser purificado para eliminar cualquier material no deseado que se haya generado durante el proceso. Los métodos comunes para esta purificación incluyen precipitación y cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). La HPLC es particularmente importante para eliminar cualquier residuo de ADN u otros subproductos que puedan interferir con la efectividad del mRNA.

#El Problema del dsRNA

Durante la producción de mRNA, puede formarse un subproducto llamado dsRNA. Este subproducto puede activar ciertos receptores en el cuerpo que, aunque son parte de la respuesta inmune, también pueden llevar a un estrés innecesario en el sistema. Cuando se acumula dsRNA, puede resultar en la producción de proteínas que quizás no se necesiten. Por eso es crucial eliminar el dsRNA del producto final de mRNA, y aunque la HPLC es un método efectivo para esto, puede sumar tiempo y costos al proceso de producción.

#T7 ARN Polimerasa y su Papel

Un jugador clave en el proceso de producción de mRNA es la polimerasa T7 ARN (T7 RNAP). Esta enzima se usa comúnmente para sintetizar ARN porque puede producir altos rendimientos y trabaja eficientemente en laboratorios.

Sin embargo, T7 RNAP no es perfecta y puede crear subproductos como fragmentos de ARN cortos o no deseados durante la transcripción. Estos subproductos pueden contribuir a la formación de dsRNA, complicando aún más las cosas.

El proceso de transcripción usando T7 RNAP ocurre en tres etapas principales: iniciación, elongación y terminación. Durante la iniciación, T7 RNAP reconoce regiones específicas del ADN para comenzar la síntesis de ARN. A medida que la cadena de ARN se alarga, sigue añadiendo nucleótidos hasta que llega al final de la plantilla de ADN.

En casos donde T7 RNAP experimenta una terminación prematura, puede llevar a cadenas de ARN acortadas o extensiones inesperadas al final del ARN. Esto puede llevar nuevamente a un aumento en los niveles de dsRNA, que son indeseados.

#Nuevas Tecnologías para la Cribado

Para mejorar las propiedades de T7 RNAP y reducir los subproductos no deseados, han surgido nuevas tecnologías como el sorteo de gotas activadas por fluorescencia (FADS). FADS es un método de cribado de alto rendimiento que permite a los investigadores clasificar gotas que contienen productos de ARN según la fluorescencia. Esta tecnología es ventajosa ya que es rápida, sensible y rentable.

En FADS, una gota contiene reactivos y células microbianas que expresan variantes de T7 RNAP. A medida que las gotas pasan por un haz de detección, se mide su fluorescencia. Solo aquellas con una intensidad de fluorescencia específica son clasificadas para un análisis posterior, lo que ayuda a identificar variantes que tienen propiedades mejoradas.

#Un Enfoque para Reducir el dsRNA

El objetivo de la investigación mencionada es encontrar formas de reducir la cantidad de dsRNA no deseado producido durante la síntesis de mRNA. Los investigadores están investigando variantes de T7 RNAP que tienen mutaciones diseñadas para ayudar a reducir los niveles de dsRNA. Usando una mezcla de evolución dirigida y estrategias de diseño, buscan crear una enzima más eficiente.

Para clasificar estas variantes de T7 RNAP de manera efectiva, los investigadores optimizaron un método que utiliza balizas moleculares: sondas especializadas que pueden unirse a secuencias de ARN específicas y emitir fluorescencia. Esto permite el monitoreo en tiempo real del rendimiento y calidad del ARN.

#Proceso de Cribado

En el desarrollo del sistema de cribado, los científicos realizaron experimentos usando diferentes plantillas de ADN y T7 RNAP. Midiendo la fluorescencia de las balizas moleculares, pudieron determinar qué tan bien funcionaba cada variante de T7 RNAP y cuánta dsRNA se generaba.

A través de las rondas iniciales de cribado, se recolectaron gotas positivas que exhibían una fluorescencia más alta. Los investigadores analizaron estas más a fondo, identificando varias variantes de T7 RNAP mutantas que mostraron niveles más bajos de dsRNA en comparación con la tipo salvaje. Algunas mutantes incluso mostraron mejoras en la integridad del ARN, sugiriendo que podrían producir un output de mRNA más confiable.

#La Importancia de la Validación de Resultados

Después del cribado inicial, los investigadores buscaron validar sus hallazgos. Esto implicó secuenciar el ADN de las gotas positivas para determinar qué mutaciones estaban presentes. Descubrieron que mutaciones específicas aparecían frecuentemente en variantes exitosas, indicando su posible importancia en la reducción de niveles de dsRNA.

Un análisis más profundo mostró que algunas variantes, aunque prometedoras en términos de bajo dsRNA, habían reducido su actividad en general. Esto resalta la necesidad de más refinamiento para asegurar que estas variantes puedan producir mRNA de alta calidad mientras minimizan los subproductos no deseados.

#Optimización de T7 RNAP

En la búsqueda de T7 RNAPs más efectivas, los investigadores se enfocaron cada vez más en varios sitios distintos dentro de la estructura de la enzima. Al estudiar cómo las mutaciones en estos sitios afectaban el rendimiento de la enzima, pudieron crear versiones de T7 RNAP que podrían funcionar de manera más efectiva.

Finalmente, los investigadores desarrollaron un método que utiliza un enfoque de doble sonda, midiendo simultáneamente el rendimiento y la calidad del ARN. Este enfoque ayuda a identificar las mejores variantes de T7 RNAP, asegurando que los mutantes elegidos cumplan con los estándares de productividad y pureza.

#Refinamientos y Hallazgos Adicionales

Tras cribear más de mil variantes, los investigadores identificaron varios mutantes que mostraron promesa al generar menos dsRNA mientras mantenían buena productividad general. Sin embargo, algunas variantes que demostraron niveles bajos de dsRNA no coincidían con el rendimiento esperado, indicando interacciones complejas en juego.

A través de una combinación de enfoques, incluyendo cribados adicionales de bibliotecas generadas por barajado de ADN, los investigadores pudieron encontrar variantes de T7 RNAP que producían consistentemente niveles más bajos de dsRNA.

#Evaluando el Impacto en la Inmunogenicidad

Un aspecto importante de la producción de mRNA es entender cómo los niveles de dsRNA afectan las respuestas inmunitarias. Los investigadores probaron sus varias variantes de T7 RNAP en células para evaluar la reacción inmune desencadenada por los productos de ARN.

Encontraron que, mientras que el T7 RNAP tipo salvaje producía una robusta respuesta inmune, muchas de las variantes mutantes resultaron en respuestas disminuidas. Este hallazgo es crucial para asegurar que el mRNA producido con fines terapéuticos o de vacunación no provoque una activación inmune innecesaria.

#Conclusión

La investigación sobre drogas y vacunas basadas en mRNA está evolucionando rápidamente, con científicos esforzándose por optimizar los procesos involucrados en su producción. Al enfocarse en mejorar el rendimiento de T7 RNAP y reducir los subproductos no deseados como el dsRNA, los investigadores buscan aumentar la efectividad de las terapias de mRNA.

A través de métodos avanzados de cribado y un sólido entendimiento de la biología subyacente, el potencial para vacunas de mRNA seguras y efectivas sigue creciendo, ofreciendo esperanza para nuevos tratamientos y medidas preventivas contra varias enfermedades.