Avances en Espectrometría de Masas Dirigida

La espectrometría de masas es una técnica que se usa para analizar la composición de diferentes sustancias midiendo su masa y la cantidad de sus componentes. En el campo de la Proteómica, que se enfoca en el estudio de las proteínas, la espectrometría de masas se ha convertido en una herramienta esencial para los investigadores en ciencia biomédica.

#El Cambio de Mediciones Cualitativas a Cuantitativas

Históricamente, los métodos de proteómica a menudo comenzaban con poco entendimiento del contenido de la muestra. Los investigadores detectaban varias proteínas y péptidos como si los estuvieran viendo por primera vez. El éxito generalmente se medía por cuántas proteínas o péptidos se podían encontrar, en lugar de la precisión de las mediciones. Esto llevó a situaciones donde los instrumentos y métodos usados para la detección pueden que no estuvieran optimizados para medir con precisión las diferencias en las concentraciones de las muestras.

En los primeros días, alrededor de los años 80 y 90, los dispositivos más comunes para la espectrometría de masas eran trampas de iones 3D. Estos dispositivos tenían limitaciones, como el número de iones que podían analizar a la vez, que era aproximadamente 1000. El enfoque durante ese tiempo era más identificar proteínas que medir con precisión sus cantidades. Aunque se hacía algo de cuantificación usando técnicas como el conteo espectral, era limitado debido a las capacidades de los instrumentos.

Con el desarrollo de la tecnología, se introdujeron trampas de iones lineales 2D. Estos dispositivos mejorados podían manejar muchos más iones, haciéndolos más efectivos para la creciente necesidad de mejor cuantificación. Por ejemplo, el LTQ Velos, una trampa de iones avanzada, mejoró la capacidad de aislar iones y analizarlos de manera más eficiente, lo cual era crucial a medida que nuevas y más poderosas fuentes de iones estaban disponibles.

Después, los instrumentos de la serie Orbitrap Fusion Tribrid combinaron varias tecnologías, permitiendo un análisis más rápido y eficiente, incluyendo el aislamiento casi instantáneo de iones precursor. Esta innovación llevó a una mejor utilización de los procesos de acumulación de iones, resultando en tasas de análisis exitosas mucho más altas.

#El Aumento de Experimentos Dirigidos

A principios de los 2000, los científicos comenzaron a darse cuenta de la importancia de dirigir la atención a proteínas específicas dentro de una muestra. Este cambio llevó al desarrollo de ensayos de espectrometría de masas dirigidos, que ofrecían una alternativa fiable a métodos tradicionales como los inmunoensayos usados en laboratorios clínicos. Con el tiempo, la proteómica dirigida ganó reconocimiento, incluso siendo nombrada "Método del Año" por una revista líder.

Un método clave que surgió durante este período fue el Monitoreo de Reacción Seleccionada (SRM), que se hacía principalmente usando espectrometría de masas de triple cuadrupolo. Este método se volvió popular porque el equipo para realizarlo ya estaba ampliamente disponible en muchos laboratorios de investigación, y ofrecía un enfoque cuantitativo riguroso, especialmente en entornos regulados.

Con el tiempo, el Monitoreo de Reacción Paralela (PRM) comenzó a convertirse en un fuerte competidor del SRM. El PRM simplificó el proceso al permitir la medición de todo el espectro de iones de producto a la vez, ayudando a los investigadores a confirmar la identidad de sus muestras mientras aumentaba la sensibilidad.

#Desafíos con la Proteómica Dirigida

A pesar de las ventajas de la proteómica dirigida, todavía había desafíos. Una limitación significativa era el número de péptidos que se podían medir. A menudo había un compromiso entre el número de analitos y la calidad de las mediciones. Para abordar esto, los investigadores desarrollaron la Adquisición independiente de datos (DIA), que permitía el análisis de muchos péptidos a la vez, aunque a veces reducía la selectividad.

Otra forma de mejorar las mediciones era incorporar la programación de tiempo de retención, donde cada péptido objetivo se monitoreaba durante un período establecido. Sin embargo, esto podría llevar a ineficiencias debido a la naturaleza impredecible de los cambios cromatográficos a lo largo del tiempo. Avances recientes han mostrado que con ajustes en tiempo real, los instrumentos podrían manejar estos cambios de manera más efectiva, permitiendo una muestreo más enfocado de péptidos.

#Desarrollo de Ensayos Dirigidos

Crear ensayos dirigidos solía ser complicado. A menudo requería un conjunto inicial de experimentos para identificar péptidos adecuados, seguido de la creación de estándares o la producción de proteínas para optimizar los métodos. La logística también planteaba desafíos, ya que determinar qué péptidos de un vasto grupo podían ser analizados de manera efectiva no era sencillo.

Desarrollos recientes han simplificado el proceso para crear ensayos dirigidos. Al usar fracciones de fase gaseosa derivadas de varios experimentos, los investigadores podían construir bibliotecas de datos de alta calidad que facilitaban realizar análisis dirigidos más adelante.

#Introduciendo el Espectrómetro de Masas Stellar

La introducción del espectrómetro de masas Stellar representó un avance significativo en la espectrometría de masas dirigida. Este dispositivo compartía muchas características con modelos anteriores, pero ponía un mayor énfasis en el análisis cuantitativo dirigido. Las mejoras en hardware y software permitieron adquisiciones más rápidas y algoritmos mejores, haciendo el proceso de análisis dirigido más eficiente.

Una de las características clave del Stellar MS fue su sistema de RT Adaptativo, que ajustaba los cambios de tiempo de retención en tiempo real. Esto permitía cambios dinámicos en los tiempos de adquisición según lo ocupado que estuviera el sistema. Además, se desarrolló una herramienta llamada PRM Conductor para facilitar la creación de ensayos dirigidos automatizando gran parte del proceso de configuración.

#Procedimientos Experimentales: Una Mirada Más Cercana

En experimentos realizados con el espectrómetro de masas Stellar, los investigadores prepararon curvas de calibración usando muestras biológicas específicas, como plasma de pollo mezclado con plasma humano. Se utilizaron varios métodos, incluyendo cromatografía líquida, que ayuda a separar la mezcla en sus componentes individuales para un mejor análisis.

La herramienta PRM Conductor, utilizada junto con el espectrómetro de masas Stellar, simplificó el proceso de generación de ensayos dirigidos. Filtró transiciones que cumplían con criterios específicos, como la intensidad de la señal y el tiempo de retención, para crear ensayos efectivos para cada péptido.

#Resultados de los Experimentos

Los experimentos mostraron resultados prometedores para el espectrómetro de masas Stellar, especialmente al comparar su rendimiento con los espectrómetros de masas de triple cuadrupolo tradicionales. El nuevo dispositivo exhibió una mejora significativa tanto en los límites de cuantificación como de detección para analizar péptidos de plasma.

Por ejemplo, en un experimento se encontró que el Stellar logró un límite de cuantificación más bajo para péptidos de plasma que los instrumentos SRM tradicionales. Además, los coeficientes de variación medianos, que indican la fiabilidad de las mediciones, estaban dentro de rangos aceptables.

Al probar un gran kit diseñado para cuantificar cientos de proteínas plasmáticas, el espectrómetro de masas Stellar demostró ser efectivo. Los puntos medianos por pico, que indican el número de puntos de datos recogidos para cada péptido, fueron más que suficientes para cumplir con los requisitos de análisis.

#El Análisis de E. Coli

Un experimento que analizaba proteínas de E. coli mezcladas con células HeLa demostró la efectividad del método de cuantificación sin etiqueta. Este enfoque permitió a los investigadores evaluar cantidades de péptidos sin necesidad de estándares pesados para cada compuesto.

El análisis arrojó miles de péptidos únicos, y los resultados mostraron que se mantuvo un alto nivel de precisión en varios ensayos. Incluso bajo condiciones desafiantes, el espectrómetro de masas Stellar pudo ofrecer resultados fiables mientras medía un gran número de péptidos en muestras diversas.

#Tiempos de Inyección y Medición de Iones

Uno de los aspectos críticos de la espectrometría de masas dirigida es entender la relación entre los tiempos de inyección y el número de iones que se miden. El espectrómetro de masas Stellar utiliza un sistema de control automático de ganancia (AGC) para optimizar el número de iones analizados en cada ciclo de medición.

Este sistema ajusta eficazmente los tiempos de inyección según la abundancia de cada objetivo, asegurando que los objetivos menos abundantes reciban más tiempo para una medición precisa. Como resultado, se lograron una mayor precisión y sensibilidad en múltiples ensayos, mostrando las ventajas del instrumento Stellar.

#Resumen y Direcciones Futuras

En general, el espectrómetro de masas Stellar demostró avances significativos en la proteómica dirigida, mostrando un mejor rendimiento en términos de sensibilidad y eficiencia en comparación con métodos tradicionales. Los investigadores observaron mejoras en los límites de cuantificación y detección, convirtiéndolo en una herramienta valiosa para análisis de alto rendimiento.

Mirando hacia el futuro, hay planes para explorar capacidades adicionales del espectrómetro de masas Stellar. La naturaleza versátil de la trampa de iones lineales permite diversas técnicas de aislamiento, lo que podría mejorar la selectividad mientras se mantiene un alto rendimiento analítico. Los estudios futuros buscarán integrar estas técnicas para mediciones aún más precisas.

En resumen, los avances en tecnología y software han hecho que la proteómica dirigida sea más accesible y eficiente, allanando el camino para estudios más completos en varios campos biológicos. El objetivo es seguir desarrollando métodos que ofrezcan mediciones fiables y sensibles, ayudando a los investigadores a entender mejor el complejo mundo de las proteínas y sus roles en la salud y la enfermedad.