Nanotiming: Un Método Económico para Mapear el Tiempo de Replicación del ADN

Los cromosomas en las células eucariotas se duplican en un orden específico. Este orden, conocido como temporización de replicación (RT), es importante para mantener la estructura de la cromatina, que es el material que forma los cromosomas. La RT está relacionada con cómo están organizados los genes en el espacio y cuán activos son durante el proceso de duplicación.

Los métodos actuales para rastrear la RT generalmente observan los cambios en el número de copias de ADN o el uso de nucleótidos especiales durante la Fase s, que es la parte del ciclo celular donde se replica el ADN. La mayoría de estos métodos requieren sincronizar células o clasificarlas en grupos según su progreso en la fase S, lo que complica la preparación de muestras. Además, los procedimientos para sincronizar células pueden interferir con el proceso de replicación del ADN.

Un método llamado análisis de frecuencia de marcadores (MFA)-seq puede medir directamente cuántas copias de secuencias de ADN están presentes en células que se dividen activamente, pero tiene una resolución limitada debido al número de células que se están replicando en un momento dado. Además, las técnicas de mapeo de RT existentes pueden ser costosas. Por ejemplo, mapear la RT de un pequeño genoma de levadura puede costar hasta $1,000 en recursos.

#Introduciendo Nanotiming

Recientemente, se han desarrollado nuevos métodos para usar un nucleósido especial, 5-bromo-2’-deoxiuridina (BrdU), para rastrear la replicación del ADN utilizando un método llamado secuenciación por poro nanométrico. En varias células eucariotas, el número de trifosfato de desoxitimidina (dTTP) aumenta durante la fase S. Esto ha llevado a la idea de usar la cantidad de BrdU encontrada en lecturas de secuenciación por poro nanométrico para estimar la RT. La premisa es que los cambios en los niveles de BrdU pueden mostrar cómo cambia el nivel de dTTP a lo largo de la fase S. Se espera que haya menos incorporación de BrdU en regiones que se replican más tarde en comparación con aquellas que se replican temprano.

El proceso, llamado Nanotiming, permite a los investigadores etiquetar células con BrdU por un solo tiempo de duplicación, luego cuantificar el BrdU en lecturas de nanoporo del genoma. Esto proporciona perfiles de RT de alta resolución sin la necesidad de clasificar o sincronizar células, lo que reduce drásticamente los costos a unos $70 por perfil cuando se secuencian múltiples muestras juntas. Este método puede alinear con precisión lecturas largas de nanoporo a secuencias altamente repetitivas, dando un perfil de RT completo de extremo a extremo del genoma.

#Metodología de Nanotiming

Para probar este método, los investigadores comenzaron con una especie de levadura conocida como S. cerevisiae, que se usa para estudiar la replicación del ADN eucariota. Usaron una cepa especial de levadura que permite una incorporación eficiente de BrdU. Se probaron múltiples concentraciones de BrdU para encontrar el nivel más efectivo para capturar el aumento de dTTP durante la fase S.

Después de exponer la levadura a diferentes concentraciones de BrdU por un tiempo de duplicación, los resultados mostraron niveles variables de BrdU entre las lecturas de nanoporo. Las mejores concentraciones se encontraron entre 5 y 20 µM de BrdU, ya que concentraciones más altas llevaron a una saturación de BrdU en el ADN. Luego, los investigadores compararon los niveles promedio de BrdU con los números de copias relativos obtenidos de sort-seq y encontraron una fuerte correlación positiva, confirmando que niveles más bajos de incorporación de BrdU indican regiones que se replican más tarde.

Al mantener una concentración constante de BrdU, los investigadores aseguraron que las células de levadura no experimentaran interrupciones en su temporización de replicación. El contenido medio de BrdU resultante coincidió estrechamente con los perfiles obtenidos a través de sort-seq, demostrando que Nanotiming podía crear mapas detallados de RT del genoma de levadura sin la necesidad de una preparación compleja de muestras.

#Aplicaciones de Nanotiming

Los investigadores probaron Nanotiming en varias cepas mutantes de levadura para ver cómo la ausencia de ciertos reguladores de replicación afectaba la RT. Mapearon con éxito la RT en cepas que carecían de proteínas regulatorias importantes, revelando que la ausencia de Ctf19 causó que ciertas regiones se replicaran tarde, mientras que la pérdida de Rif1 hizo que algunos telómeros se replicaran antes.

Curiosamente, al estudiar los telómeros de los cromosomas de levadura, encontraron que no todos los telómeros se vieron afectados de la misma manera por la ausencia de Rif1. El método mostró que Rif1 regula directamente solo un subconjunto de telómeros, particularmente aquellos con secuencias subteloméricas específicas.

En otro aspecto de sus pruebas, los investigadores analizaron las longitudes de los telómeros individuales junto con su temporización de replicación. No encontraron una conexión clara entre la longitud del telómero y la temporización de replicación, excepto por una ligera tendencia en una cepa mutante específica. Los telómeros mostraron una temporización de replicación tardía en general, pero ciertos telómeros tenían tiempos de replicación más tempranos independientemente de sus longitudes.

#Eficiencia de Costos de Nanotiming

Una ventaja significativa de Nanotiming es su rentabilidad y potencial para aplicaciones a gran escala. Al usar secuenciación multiphase, múltiples muestras se pueden procesar simultáneamente, reduciendo drásticamente el costo por perfil genómico. Esta accesibilidad podría permitir que muchos laboratorios realicen estudios de RT que antes estaban limitados por restricciones de recursos.

En comparación, los métodos tradicionales requieren más recursos y pueden ser mucho más costosos. La capacidad de realizar muchos análisis de RT en una sola ejecución con costos mínimos hace que Nanotiming sea una opción práctica para los investigadores.

#Conclusión: El Futuro de Nanotiming

Nanotiming representa un avance significativo en el campo de los estudios de replicación cromosómica. Simplifica el proceso de obtención de perfiles de RT de alta resolución y amplía el potencial para análisis a gran escala. El método aporta claridad a las complejidades de la replicación en telómeros individuales y podría llevar a nuevos conocimientos sobre los mecanismos que regulan la integridad de los cromosomas.

En general, este nuevo enfoque no solo mejora nuestra comprensión de cómo se duplican los cromosomas, sino que también allana el camino para aplicaciones más amplias e investigaciones sobre los mecanismos de replicación de varios organismos. Con su facilidad de uso y bajo costo, Nanotiming está destinado a convertirse en una herramienta ampliamente adoptada en el estudio de la replicación del ADN y la dinámica de la cromatina.