Un nuevo enfoque para el muestreo metagenómico

A medida que enfrentamos la amenaza de pandemias, es esencial contar con herramientas efectivas para ayudarnos a reconocer peligros potenciales temprano. Una de estas herramientas es el muestreo metagenómico ambiental. Este método permite a los científicos recolectar muestras de varios entornos para identificar posibles patógenos, especialmente aquellos que pueden saltar de animales a humanos. Al estudiar estas muestras, los investigadores pueden actuar rápido para prevenir brotes.

#El Proceso de Muestreo Metagenómico

Cuando los científicos reciben muestras de pacientes que no tienen una causa obvia, miran datos ambientales para encontrar conexiones. Esto es crucial para entender eventos zoonóticos, donde las enfermedades se pasan de animales a humanos. El proceso generalmente comienza con la recolección de muestras ambientales. Luego, estas muestras pasan por una etapa llamada Secuenciación de genoma completo, donde se lee y registra el ADN.

Las tecnologías de secuenciación de ADN de hoy, como las desarrolladas por Illumina, pueden producir cantidades enormes de datos, generando millones, si no miles de millones, de secuencias cortas de ADN compuestas de pares de bases (A, C, G, T). Sin embargo, analizar estos datos y hacer coincidir con genomas de referencia conocidos toma mucho tiempo, lo que puede frenar nuestra capacidad para responder a posibles brotes de enfermedades.

Para mejorar esto, tener una base de datos metagenómica ambiental sólida que sea fácil de buscar permitiría a los investigadores encontrar más rápido los orígenes de los brotes, saltándose algunos de los pasos de análisis más lentos.

#El Problema con los Métodos Existentes

En muchos métodos actuales que dependen de la Alineación de genomas, un número significativo de secuencias de ADN no coincide con ningún genoma de referencia conocido. Esto significa que quedan sin identificar, lo que es un desafío al intentar abordar nuevas enfermedades. El problema radica en la diversidad genética y la presencia de secuencias desconocidas dentro de estas muestras Metagenómicas. Como resultado, gran parte de estos datos queda sin examinar, aunque son cruciales para la preparación contra pandemias.

Para abordar esto, algunas técnicas comienzan dividiendo las secuencias de ADN en partes más pequeñas conocidas como K-mers. La idea es que si dos secuencias tienen similitudes, deberían compartir algunos de estos k-mers. Mientras que algunas herramientas, como Kraken, hacen un buen trabajo encontrando patógenos conocidos, tienen problemas para identificar nuevos patógenos sin genomas de referencia.

A pesar de que hay varias herramientas de k-mer disponibles, generalmente requieren mucho espacio de almacenamiento, haciendo esencial encontrar maneras de reducir estas necesidades de almacenamiento y acelerar el proceso de búsqueda.

Otra clase de métodos llamada pseudo-alineación puede estimar rápidamente si las secuencias son similares. Aunque estos métodos pueden revelar si secuencias específicas existen en un conjunto de datos, a menudo no logran proporcionar información detallada sobre su relevancia biológica, lo cual es vital para estudios epidemiológicos exhaustivos.

#La Necesidad de una Nueva Herramienta

Hay una clara necesidad de una nueva herramienta de búsqueda capaz de identificar y recuperar secuencias relevantes de conjuntos de datos metagenómicos extensos rápidamente. Esta herramienta debería enfocarse en "coincidencias parciales", donde las secuencias no se alinean perfectamente pero aún comparten algunas similitudes. Estas coincidencias parciales podrían incluir coincidencias exactas así como regiones con discrepancias, que a menudo son pasadas por alto por herramientas existentes.

Por ejemplo, herramientas como BWA pueden perder alineaciones más pequeñas, y BLAST a veces tiene problemas con regiones que contienen discrepancias significativas. Estos vacíos pueden llevar a que datos críticos queden sin examinar, lo cual podría ser perjudicial para identificar los orígenes de las enfermedades.

Dadas estas lagunas en las soluciones actuales, presentamos una nueva herramienta llamada PArtial Read Matching with Inexpensive K-mers (PARMIK). PARMIK está diseñado para identificar rápidamente coincidencias parciales entre secuencias de muestras de pacientes y conjuntos de datos metagenómicos.

#Cómo Funciona PARMIK

PARMIK sigue un proceso sencillo de cuatro pasos: indexación, pre-filtrado, alineación y post-filtrado.

#1. Indexación

En el primer paso de PARMIK, selecciona solo k-mers que ocurren con poca frecuencia en el conjunto de datos. Estos se llaman k-mers baratos. Al filtrar los k-mers que ocurren frecuentemente (k-mers caros), que proporcionan poca información útil, la herramienta reduce el uso de memoria. Los k-mers baratos restantes se organizan en un índice invertido, lo que ayuda a acceder rápidamente a los datos más tarde.

#2. Pre-filtrado

Luego, durante la etapa de pre-filtrado, PARMIK recolecta lecturas de los datos metagenómicos que comparten un número predeterminado de k-mers baratos con la consulta. Este paso reduce el grupo de coincidencias potenciales, facilitando la identificación de alineaciones significativas en el siguiente paso.

#3. Alineación

PARMIK luego pasa a la etapa de alineación, donde utiliza una implementación rápida del algoritmo de Smith-Waterman, llamado SSW, para procesar la consulta y sus coincidencias candidatas. Diferentes puntajes de penalización ayudan a determinar la mejor alineación entre cada par de secuencias, enfocándose en hacer las coincidencias más significativas.

#4. Post-filtrado

El paso final implica revisar los resultados de alineación contra los criterios definidos por el usuario, incluyendo umbrales específicos para la identidad porcentual y el tamaño de la alineación. El objetivo aquí es maximizar el tamaño de las alineaciones asegurando que cumplan con estos criterios.

#Rendimiento y Comparación

Al comparar PARMIK con otras herramientas como BLAST y BWA, PARMIK mostró resultados prometedores. Con un umbral de identidad porcentual establecido, PARMIK logró una tasa de recuperación más alta que BLAST, lo que significa que identificó con éxito más secuencias relevantes. Además, PARMIK fue más rápido en proporcionar resultados, especialmente cuando se procesa en paralelo sobre muchos núcleos.

Mientras que BLAST es conocido por su velocidad, la fortaleza de PARMIK radica en su capacidad para proporcionar resultados precisos incluso en casos donde BLAST podría perder alineaciones. Esto es crucial para la investigación epidemiológica, donde entender los orígenes de los patógenos puede ser vital.

#Uso de Memoria y Eficiencia

Una de las características destacadas de PARMIK es su uso eficiente de memoria. Al filtrar los k-mers caros, PARMIK no solo acelera el análisis sino que también reduce significativamente el tamaño de sus índices, facilitando el manejo de conjuntos de datos más grandes.

#Manejo de Errores de Secuenciación

Otro desafío con los datos metagenómicos es la presencia de errores de secuenciación y secuencias de ADN repetitivas que pueden entorpecer el conjunto de datos. Dado que PARMIK opera en entornos sin genomas de referencia, busca minimizar estos errores enfocándose en k-mers baratos, manteniendo el análisis eficiente y el conjunto de datos manejable.

#Pruebas con Conjuntos de Datos Reales

PARMIK fue evaluado con conjuntos de datos reales, mostrando un rendimiento superior en la identificación de alineaciones relevantes. Ya sea mirando secuencias más largas o filtrando a través de varias condiciones, PARMIK encontró consistentemente más coincidencias en comparación con las herramientas existentes.

#La Importancia de Pulir

PARMIK emplea una técnica de pulido en su etapa de post-filtrado, que ayuda a mejorar los tamaños de alineación después del procesamiento inicial. Esto puede llevar a resultados mejores y más significativos, asegurando que las alineaciones identificadas no solo sean precisas sino también útiles para un análisis posterior.

#Conclusión

El rápido avance de la tecnología de secuenciación de ADN ofrece un gran potencial para identificar patógenos y entender enfermedades. Sin embargo, aún quedan desafíos, particularmente cuando se trata de analizar conjuntos de datos metagenómicos diversos y complejos.

PARMIK se destaca como una herramienta prometedora en este campo, ofreciendo una manera más eficiente de identificar coincidencias parciales, ayudando así a los investigadores a dar sentido a grandes cantidades de datos. Al priorizar k-mers baratos y simplificar el proceso de coincidencia y alineación, PARMIK mejora nuestra capacidad para responder rápidamente a posibles pandemias.

En general, PARMIK no solo llena un vacío en las metodologías actuales; allana el camino para una mejor preparación y respuesta ante pandemias, permitiendo que los funcionarios de salud pública y los investigadores utilicen los datos metagenómicos de manera más efectiva.