Avanzando en la ingeniería de proteínas con aminoácidos no canónicos

En el mundo de las proteínas, hay ciertos bloques de construcción conocidos como aminoácidos que se juntan para formar cadenas, cuya estructura es crucial para cómo funciona una proteína. La mayoría de las veces, nos quedamos con los sospechosos habituales, los aminoácidos canónicos. Sin embargo, hay algunos personajes inusuales, llamados aminoácidos no canónicos (ncAAs), que pueden agitar un poco las cosas. Estos ncAAs pueden darle a las proteínas nuevas habilidades o ayudarlas a hacer mejor su trabajo. Los científicos han ideado un método para introducir estos ncAAs en proteínas dentro de células vivas, y todo gracias a algo llamado tecnología de Expansión del Código Genético.

#Lo Básico de la Expansión del Código Genético

Entonces, ¿cómo funciona todo esto? Imagina que tienes una receta que solo permite un número limitado de ingredientes. La expansión del código genético es como añadir algunos ingredientes nuevos y elegantes a la mezcla. Sin embargo, para que esto suceda, los científicos necesitan un par especial de ayudantes: una aminoacil-tRNA sintetasa (aaRS) y un tRNA que normalmente no se mezcla con la multitud celular habitual. Este par especial puede reconocer y añadir los ncAAs deseados a las proteínas cuando aparece la señal correcta (un codón sin sentido reciclado).

#Encontrando el Par Correcto

Para asegurarse de que el nuevo par no se confunda con los que ya están en la célula, los científicos a menudo los toman prestados de diferentes tipos de organismos como bacterias, arqueas o eucariotas. Esto significa que cuando hacemos esto en bacterias, podríamos tomar la aaRS de arqueas o eucariotas, mientras que en células eucariotas podríamos tomarlas de bacterias o arqueas. ¡Es como reunir ingredientes de diferentes partes del mundo para hacer un plato único!

#Ampliando el Uso de la Tecnología GCE

Esta tecnología ha avanzado para funcionar en células eucariotas, incluidas las células mamarias. Esto ha abierto nuevas posibilidades emocionantes para estudiar cómo funcionan las células y para crear nuevos bioterapéuticos. Varios pares de aaRS/tRNA han sido modificados para permitir la incorporación de diferentes ncAAs en proteínas en eucariotas. Algunos de estos pares provienen de E. coli, arqueas e incluso mezclas personalizadas conocidas como pares quiméricos.

Si bien se han introducido muchos ncAAs en células eucariotas, la mayor parte del éxito proviene de usar un par en particular (los pares de pirrolisina). La razón de esto es que la sintetasa de pirrolisina es bastante flexible y se puede ajustar utilizando métodos simples disponibles en E. coli. Sin embargo, los científicos necesitan acceso a más pares diseñados para aumentar la variedad de ncAAs que pueden usar.

#El Atractivo Par de Leucil-tRNA Sintetasa de E. coli

Un jugador prometedor en el juego es el par de leucil-tRNA sintetasa de E. coli (EcLeuRS)/tRNA. Durante más de 20 años, EcLeuRS se ha adaptado para añadir un conjunto pequeño pero diverso de ncAAs. Aunque ha logrado cierto progreso, todavía se queda atrás de su homólogo de pirrolisina cuando se trata del número de ncAAs utilizables. Un problema en el proceso es que los métodos utilizados para modificar EcLeuRS en levaduras no han sido los mejores.

Para mejorar el juego, los investigadores han desarrollado dos sistemas basados en levaduras para seleccionar mutantes útiles de EcLeuRS. El primero es una selección basada en la supervivencia que utiliza una versión rota de un activador transcripcional, y el segundo utiliza un método de clasificación fluorescente llamado FACS. El sistema basado en la supervivencia ha sido más popular ya que permite probar grupos más grandes de mutantes en menos tiempo.

#Mejorando el Sistema de Selección

Sin embargo, el sistema de selección existente basado en la supervivencia para EcLeuRS puede tener problemas. Por ejemplo, a veces permite que los mutantes incorrectos sobrevivan debido a un pequeño gremlin llamado "expresión con fugas". Después de algunos experimentos, los investigadores descubrieron que podían mejorar la rigurosidad de la selección añadiendo otro codón de parada en el gen del factor de transcripción. Esto significa que solo se seleccionarían aquellos mutantes que realmente hacen el trabajo.

Al hacer estos ajustes, los investigadores pudieron encontrar de manera eficiente nuevos mutantes de EcLeuRS que pudieran aceptar varios ncAAs, lo que llevó a un emocionante aumento en su caja de herramientas de ncAAs. Se centraron en tres ncAAs destacados como el ácido 2-aminocaprílico, ONBC (un derivado de citrulina fotocontrolada) y Kacme (una nueva modificación para modificaciones post-traduccionales de lisina).

#Evolución Dirigida para Mejorar EcLeuRS

Con el nuevo sistema de selección en marcha, los científicos estaban ansiosos por modificar aún más EcLeuRS. Crearon una biblioteca de mutantes cambiando partes específicas de la estructura de EcLeuRS. Esto significó que pudieron encontrar mutantes que pudieran reconocer e incorporar específicamente los nuevos ncAAs. Después de unas cuantas rondas de selección, pudieron identificar varios mutantes exitosos.

También enfrentaron un problema de "trampa" donde algunos clones no codificaban las mutaciones necesarias pero aún así sobrevivían a la selección. Para resolver esto, en lugar de reutilizar las mismas células de levadura para cada ronda de selección, aislaron el ADN prometedor y lo introdujeron en células frescas. Esto llevó a resultados mucho mejores y ayudó a eliminar a los tramposos.

#La Búsqueda de una Incorporación Efectiva de ncAA

Después de confirmar la funcionalidad de su sistema de selección mejorado, los investigadores decidieron concentrarse en hacer mutantes de EcLeuRS que pudieran incorporar eficientemente ONBC. Este ncAA es importante para añadir una modificación específica (citrulina) que puede impactar en cómo funcionan las proteínas. Al llevar a cabo su proceso de selección, encontraron varios clones que podían usar ONBC con éxito y producir las proteínas deseadas.

En otro experimento, buscaron introducir Kacme en las proteínas; esta modificación se ha vinculado a la regulación de la expresión génica. Los científicos tuvieron que crear un mutante especial de EcLeuRS para lograr esta tarea, lo cual hicieron a través de su sistema de selección optimizado. Evaluaron la eficiencia de estas nuevas variantes, y muchas mostraron resultados excelentes en células mamarias.

#Polispecificidad: Una Sorpresa Espectacular

Curiosamente, descubrieron que algunos de sus nuevos mutantes de EcLeuRS eran "super-polispecíficos," lo que les permitía incorporar una amplia gama de ncAAs. Esto fue bastante inesperado, ya que parecía que podían cargar varios aminoácidos inusuales sin modificaciones adicionales. Desbloquearon el potencial de incluir diferentes funcionalidades en proteínas sin empezar desde cero.

Para darte una idea, algunos de estos mutantes permiten la incorporación de etiquetas especiales o modificaciones que pueden ayudar a los científicos a rastrear proteínas o entender mejor cómo funcionan. ¡Es como tener una navaja suiza para modificaciones de aminoácidos, con muchas herramientas para diversos trabajos!

#La Importancia de la Ornitina

La ornitina, un aminoácido no canónico, tiene aplicaciones naturales en proteínas y puede ser particularmente útil en el estudio de péptidos bioactivos. Sin embargo, incorporarla directamente puede ser complicado debido a la inestabilidad en el emparejamiento típico de aminoácido-tRNA. Para solucionar esto, los investigadores crearon una versión fotocontrolada llamada ONBO, que se puede incorporar fácilmente y activar con luz.

Se alegraron cuando uno de sus nuevos mutantes de EcLeuRS, B11, pudo incorporar ONBO fácilmente en las proteínas. Al exponerse a la luz, liberaría ornitina, abriendo una nueva vía para estudios bioquímicos.

#Conclusión

El avance de las tecnologías que permiten la adición de aminoácidos no canónicos a las proteínas ha allanado el camino para nuevos descubrimientos en biología molecular. Al optimizar los métodos de selección y diseñar mutantes eficientes de EcLeuRS, los investigadores han ampliado significativamente su caja de herramientas. A medida que continúan explorando esta área, las posibilidades de cómo estos nuevos aminoácidos pueden ser utilizados en investigaciones y medicina apenas están comenzando a desplegarse.

Considera esto como un viaje culinario donde los chefs (científicos) siguen mejorando sus recetas (métodos) para crear platos (proteínas) más diversos y emocionantes que podrían cambiar la forma en que tratamos enfermedades o entendemos los procesos celulares en el futuro. Así que, la próxima vez que pienses en proteínas, ¡recuerda que hay todo un mundo de ingredientes no convencionales esperando ser explorados!