Nuevo método mejora estudios de CRISPR en ratones

CRISPR es una herramienta que se usa en genética para editar genes. Los científicos utilizan CRISPR para averiguar qué hacen genes específicos en organismos vivos. Este proceso se llama una pantalla genética. Usando CRISPR, los investigadores pueden mirar muchos genes a la vez para aprender más sobre sus funciones. Este método ayuda a responder preguntas biológicas importantes.

A menudo, estas pantallas genéticas se realizan en células que se cultivan en entornos artificiales, llamados células cultivadas. Aunque esta configuración es útil, tiene sus límites. Por ejemplo, las células cultivadas no representan completamente cómo funcionan las cosas en organismos vivos reales, donde diferentes tipos de células y condiciones interactúan de formas complejas. Esto es especialmente cierto para órganos como el cerebro, que tiene muchos tipos diferentes de células que trabajan juntas.

Para abordar estas limitaciones, los investigadores han comenzado a usar un método llamado pantallas CRISPR agrupadas in vivo. Este método implica estudiar los cerebros de ratones vivos. Al hacerlo, los científicos esperan descubrir nuevos conocimientos que podrían pasarse por alto en células cultivadas.

#Limitaciones de las Células Cultivadas en las Pantallas CRISPR

Cuando se realizan pantallas CRISPR en células cultivadas, los científicos a menudo se enfrentan a desafíos. Un problema significativo es que el entorno en las células cultivadas no imita las condiciones naturales de un organismo completo. Factores como el envejecimiento, la inflamación y la enfermedad no pueden replicarse completamente en células cultivadas.

Esto es especialmente importante para estudiar el cerebro. El cerebro consta de diferentes tipos de células que interactúan de maneras difíciles de replicar fuera del cuerpo. Por lo tanto, usar animales vivos para estos experimentos puede proporcionar información más relevante sobre la función cerebral y las enfermedades relacionadas.

#Pantallas CRISPR In Vivo en Ratones

Algunos estudios ya han investigado el uso de CRISPR en cerebros de ratones vivos. En estos estudios, los científicos entregaron componentes de CRISPR usando virus que pueden propagarse por todo el cerebro. La mayoría de estos primeros esfuerzos utilizaron un tipo de virus llamado lentivirus. Sin embargo, la entrega de lentivirus tiene algunos inconvenientes significativos, como la distribución desigual dentro del cerebro.

Para mejorar esto, los investigadores han cambiado a usar un virus diferente llamado virus adeno-asociado (AAV). El AAV puede alcanzar más áreas del cerebro y puede funcionar mejor con la tecnología CRISPR. Esto ha llevado a una nueva técnica poderosa llamada AAV-Perturb-Seq, que permite a los investigadores recopilar información detallada sobre cómo funcionan diferentes genes en tipos específicos de células cerebrales.

Desafortunadamente, aunque el AAV es una mejor opción, los costos de hacer estos experimentos en muchos ratones y un gran número de células siguen siendo bastante altos. Estudios anteriores usaron bibliotecas de solo un pequeño número de genes, limitando el alcance de los descubrimientos.

#Introduciendo CrAAVe-seq

Para abordar los problemas que han surgido con las pantallas CRISPR in vivo, se desarrolló un nuevo método llamado "secuenciación de episomas AAV para la pantalla CRISPR" o CrAAVe-seq. Esta nueva estrategia añade una herramienta genética especial para ayudar a enfocarse en tipos celulares particulares en el cerebro. Utiliza un virus que puede entregar instrucciones de CRISPR específicamente donde se necesita, permitiendo examinar las funciones de los genes en poblaciones celulares específicas.

CrAAVe-seq también mejora la capacidad de analizar grandes volúmenes de información genética. Al usar episomas derivados de AAV, los científicos pueden aumentar la cantidad de muestras que pueden explorar sin incurrir en costos excesivos. La técnica permite a los investigadores investigar una gama más amplia de genes mientras analizan eficientemente los datos.

Usando CrAAVe-seq, los investigadores han estudiado con éxito genes que son esenciales para la supervivencia de Neuronas en los cerebros de ratones. Probaron bibliotecas que contenían miles de diferentes componentes de CRISPR y muestrearon millones de neuronas, revelando una alta reproducibilidad en los resultados.

#Cómo Funciona CrAAVe-seq

El método CrAAVe-seq comienza con un virus específico (AAV) que lleva una biblioteca de herramientas CRISPR diseñadas para dirigirse a diferentes genes en el cerebro del ratón. El AAV también contiene un marcador que permite a los científicos ver qué células están siendo atacadas.

Los investigadores inyectaron el virus en los cerebros de ratones neonatales, donde se propagó e integró en las células objetivo. La introducción de Cre recombinasa, una herramienta genética que ayuda a activar el sistema CRISPR selectivamente en ciertas células, permitió una investigación enfocada de las neuronas.

Después de unas semanas, los científicos pudieron recolectar muestras del Material Genético presente en el cerebro. Se enfocaron específicamente en analizar los componentes de CRISPR que habían sido activados en neuronas objetivo. Usando métodos de PCR y secuenciación, midieron con qué frecuencia cada gen fue atacado y qué efectos tuvieron estas acciones en las neuronas.

#Hallazgos Clave de los Estudios CrAAVe-seq

En su trabajo, los investigadores pudieron descubrir varios genes críticos para la supervivencia de neuronas. Los estudios mostraron que la reducción de ciertos genes conducía a la muerte de neuronas, lo que significa que estos genes son esenciales para mantener a las neuronas sanas.

Muchos de los genes identificados ya se sabía que eran importantes para la supervivencia celular en otros contextos, particularmente en la investigación del cáncer. Sin embargo, CrAAVe-seq también reveló varios genes únicos que no se habían relacionado con la supervivencia de neuronas antes. Esto sugiere la necesidad de seguir investigando estos genes para entender mejor sus roles.

Los resultados mostraron que CrAAVe-seq puede identificar de manera confiable genes esenciales para la salud de las neuronas y puede reproducir estos hallazgos en múltiples ratones. El método tiene el potencial de descubrir aún más genes importantes relevantes para enfermedades neurológicas.

#Ventajas de Usar AAV en Pantallas CRISPR

Los AAV tienen varias ventajas sobre otros métodos utilizados previamente en pantallas CRISPR. Pueden propagarse más efectivamente dentro del cerebro, lo que permite un análisis más amplio de diferentes tipos celulares. La capacidad de enfocarse en subpoblaciones específicas de células, como las neuronas, permite una comprensión más precisa de las funciones de los genes.

Además, los AAV no se integran en el genoma de las células que infectan, lo que significa que no cambian permanentemente las células. Esto proporciona un método más seguro de manipulación genética sin los riesgos que conlleva la integración de ADN extraño.

CrAAVe-seq también se beneficia de su diseño escalable. Al usar AAV, los investigadores pueden analizar grandes cantidades de genes manteniendo los costos manejables. El método permite una flexibilidad significativa para estudiar una amplia variedad de genes en varios tipos de células.

#Usando CrAAVe-seq para Estudiar Poblaciones Específicas de Neuronas

Uno de los aspectos emocionantes de CrAAVe-seq es su adaptabilidad para enfocarse en poblaciones específicas de neuronas. Al usar diferentes herramientas de Cre recombinasa, los investigadores pueden aislar y estudiar grupos más pequeños de neuronas dentro del tejido cerebral más grande. Incluso han comenzado a usar este método para investigar regiones cerebrales que son desafiantes de estudiar.

Por ejemplo, al usar un tipo diferente de conductor Cre que se dirige a neuronas excitatorias, los científicos pudieron perfilar los genes esenciales en estos tipos específicos de neuronas. Esto reveló patrones similares a los encontrados en pantallas más amplias, confirmando que CrAAVe-seq puede ofrecer perspectivas confiables a través de diferentes poblaciones neuronales.

#Superando Desafíos con CRISPR en Poblaciones Pequeñas

Trabajar con poblaciones más pequeñas de células presenta desafíos para los investigadores, como asegurarse de que se tomen suficientes muestras para detectar funciones reales de genes. CrAAVe-seq no solo permite un análisis amplio, sino que también proporciona la capacidad de acercarse a tipos de neuronas menos comunes.

Esta adaptabilidad es importante porque ciertas funciones de genes podrían volverse evidentes solo al enfocarse en subpoblaciones específicas. El método permite un enfoque más matizado para estudiar la función de los genes, lo cual es particularmente útil para entender los muchos roles que los genes desempeñan en diferentes contextos.

#El Futuro de CrAAVe-seq en Neurociencia

La capacidad de estudiar poblaciones neuronales de manera más efectiva a través de CrAAVe-seq trae oportunidades emocionantes para la investigación futura en neurociencia. Los investigadores pueden aplicar este método para investigar cómo varios genes afectan a enfermedades neurológicas y otros trastornos cerebrales.

La esperanza es que al descubrir más sobre qué genes son esenciales para la salud de las neuronas, los científicos puedan abrirse camino hacia nuevos tratamientos y estrategias terapéuticas dirigidas a proteger a las neuronas de daños o mejorar su supervivencia.

Usar CrAAVe-seq proporciona una forma práctica y rentable de realizar estudios a gran escala. Dado que puede manejar bibliotecas vastas de información genética, abre la puerta para explorar una amplia gama de preguntas biológicas. Esta versatilidad es esencial para estudiar condiciones complejas y a menudo poco comprendidas como la neurodegeneración.

#Conclusión

CrAAVe-seq es una herramienta poderosa para avanzar en nuestra comprensión de cómo funcionan los genes en el cerebro. Al combinar las capacidades de los vectores virales con la precisión de la tecnología CRISPR, los investigadores ahora pueden explorar las complejas interacciones entre varios genes y células cerebrales.

Los resultados de CrAAVe-seq muestran promesas para identificar genes esenciales relacionados con la supervivencia de neuronas. A medida que esta técnica madura, tiene el potencial de revelar información significativa no solo en neurociencia, sino también en campos relacionados donde entender las funciones genéticas es crucial.

Al seguir desarrollando métodos que permitan investigaciones más profundas en organismos vivos, CrAAVe-seq puede contribuir enormemente a futuros descubrimientos que den forma a nuestra comprensión de la biología y conduzcan a mejores resultados de salud. El futuro de la neurociencia y la investigación genética es brillante, y herramientas como CrAAVe-seq están a la vanguardia de este emocionante viaje.