A Interferência de RNA Revela Genes Chave na Meiose Feminina

As telas genéticas são ferramentas importantes para descobrir quais genes são necessários para diferentes processos biológicos. Os cientistas usaram essas telas para estudar problemas com a Meiose feminina, que é um tipo especial de divisão celular. Alguns pesquisadores usaram mutantes encontrados em populações naturais, enquanto outros criaram mutações usando produtos químicos ou métodos especiais que inserem novos genes nos Cromossomos. A maioria dessas telas se concentrou em tornar os cromossomos mutantes homozigotos, ou seja, tinham duas cópias idênticas de um gene. Esse método foi útil para encontrar mutações recessivas que causaram problemas como a produção de muitos descendentes anormais devido à não separação dos cromossomos durante a meiose.

Embora fosse eficaz, essa abordagem tinha limitações. Exigir que as mutantes fêmeas fossem viáveis e férteis significava que mutações letais ou que causavam esterilidade não podiam ser detectadas. Além disso, só identificava mutações que causavam especificamente a não separação, ignorando outros problemas potenciais. Uma melhoria veio com o uso de uma técnica que cria clones germinativos homozigotos por meio de um processo chamado recombinação mitótica. Esse método permitiu que os pesquisadores tornassem cromossomos específicos homozigotos em células germinativas enquanto os mantinham heterozigotos no resto do corpo, possibilitando o estudo de mutações que normalmente seriam letais.

Outro avanço envolveu o uso de Interferência de RNA (RNAi) para reduzir a atividade de genes específicos de maneira direcionada. O RNAi aproveita um mecanismo de defesa natural nas células, introduzindo uma sequência que combina com o gene-alvo. Isso leva à degradação do RNA mensageiro (mRNA) para aquele gene, reduzindo efetivamente seus níveis. Em muitos casos, isso pode reduzir a expressão gênica em 80 a 95%. Em moscas-das-frutas, os cientistas criaram coleções de construções de RNAi que podem ser ativadas em tecidos específicos, permitindo que eles examinassem os efeitos de mutações que normalmente seriam letais.

Usando esse método, os pesquisadores do nosso laboratório têm estudado dois eventos-chave que acontecem nas primeiras etapas da meiose feminina. O primeiro é a congressão dos cromossomos, que se refere a como os cromossomos se movem e se alinham corretamente durante a divisão celular. Drosófilas, ou moscas-das-frutas, têm sua oogênese dividida em 14 estágios com base em seu desenvolvimento. A transição do estágio 12 para o 13 marca o fim de uma fase da divisão celular e o começo de outra. Durante esse tempo, estruturas do fuso se formam, e os cromossomos começam a se separar.

Sem pontos de troca, conhecidos como quiasmas, os cromossomos não trocados ainda permanecem conectados. Esses cromossomos se movem em direção a lados opostos do fuso. Eventualmente, eles devem se unir na placa metafásica para formar uma estrutura compacta antes da divisão celular. Se essa congressão não acontecer corretamente, problemas como aneuploidia podem surgir, levando a gametas com números incorretos de cromossomos.

#Estudando Filamentos Ooplasmáticos

O segundo foco da nossa pesquisa é entender os filamentos ooplasmáticos, que foram observados pela primeira vez quando proteínas específicas se localizaram neles. Esses filamentos aparecem pouco depois da quebra da vesícula germinal e parecem se desassemblar logo após o ovo ser ativado e fertilizado. Certas proteínas mostram um comportamento dinâmico, se ligando a esses filamentos em resposta a mudanças ambientais.

Os pesquisadores usaram técnicas de imagem especiais para visualizar esses filamentos e notaram que eles têm uma estrutura única. No entanto, apesar de tentarem identificar as proteínas que formam esses filamentos, ainda não está claro do que exatamente eles são feitos, o que complica a compreensão de seus papéis nos processos meios.

No nosso laboratório, realizamos uma triagem citológica para testar uma coleção de construções de RNAi para encontrar genes essenciais para esses dois processos na meiose feminina. Nos concentramos em analisar ovos não fertilizados para identificar genes que poderiam ter causado letalidade se estudados da maneira tradicional. Isso envolveu cruzar machos de uma linhagem específica de RNAi com fêmeas que expressavam drivers específicos para induzir RNAi para genes-alvo particulares. Os Oócitos foram então examinados sob um microscópio para identificar quaisquer defeitos em seu desenvolvimento.

O defeito de congressão levaria a múltiplas massas de cromossomos, enquanto defeitos nos filamentos mostrariam uma ausência completa dos filamentos ou mudanças significativas em sua estrutura. Como telas de RNAi anteriores haviam identificado vários genes que levaram a uma falha na formação dos ovos, nós re-testamos essas linhagens com um driver diferente que ativa mais tarde no desenvolvimento do ovo.

#Processo de Triagem

Nós triamos mais de 1.400 construções de RNAi, descobrindo genes conhecidos e desconhecidos relacionados à meiose. Muitos dos genes que testamos não haviam sido examinados anteriormente, e reconhecemos que mutantes meios conhecidos anteriormente poderiam servir como controles valiosos em nossa análise. Das construções testadas, registramos muitos resultados negativos; no entanto, identificamos com sucesso várias linhagens com defeitos interessantes.

O processo de triagem nos permitiu separar as linhagens em várias categorias. A primeira categoria incluiu resultados negativos, onde nenhum defeito foi notado. A segunda categoria incluiu linhagens que eram inatestáveis, ou seja, não produziram oócitos maduros. A terceira categoria incluiu linhagens que não exibiram defeitos nos oócitos quando testadas. Finalmente, identificamos uma categoria de linhagens com acertos específicos que mostraram defeitos, os quais estamos especialmente interessados em estudar mais a fundo.

#Características dos Defeitos de Congressão

O defeito de congressão que observamos envolveu cromossomos meios que falharam em se unir em uma única massa, resultando em múltiplas massas de DNA no estágio em que os ovos estavam parados antes da divisão. Notamos problemas como a degradação de cromossomos meios ou estruturas anormais, como arranjos incorretos de heterocromatina.

#Metodologia de Triagem

Para facilitar nossa triagem, usamos uma abordagem sistemática. Pedimos linhagens de RNAi e as cruzamos com estoques testadores apropriados para avaliar os fenótipos. Após os cruzamentos, dissecamos os ovários, fixamos e manchamos as amostras para observação sob um microscópio. O processo simplificado nos permitiu analisar muitas amostras de forma eficiente.

Nossos resultados indicaram que muitos dos genes identificados eram vitais para a meiose, com um número significativo de linhagens sendo estéreis ou semi-estéreis quando o RNAi foi induzido. Isso confirmou nossa hipótese de que métodos de triagem tradicionais podem ter perdido muitos genes críticos devido a seus efeitos letais ou de esterilidade.

#Resultados da Triagem

Nós categorizamos os resultados de nossos esforços de triagem em grupos com base na presença ou ausência de defeitos. Muitas linhagens produziram oócitos pontuáveis sem defeitos, enquanto outras caíram na categoria inatestável. Um número menor mostrou defeitos claros nos processos celulares que estávamos estudando.

Entre os acertos que identificamos, observamos vários genes anteriormente não caracterizados, ampliando nossa compreensão do panorama genético relacionado à meiose feminina.

#Análise de Ontologia Genética

Para analisar nossos resultados mais a fundo, realizamos uma análise de Ontologia Genética para ver a quais processos biológicos os genes pertencem. Descobrimos que os genes variavam bastante em função, com muitos associados ao metabolismo de RNA. Alguns genes estavam implicados em processos essenciais para eventos de meiose e ciclo celular, enquanto outros desempenhavam papéis críticos na organização de componentes celulares.

#Conclusão

Este estudo destacou a utilidade do uso da interferência de RNA como uma ferramenta poderosa para identificar genes importantes envolvidos na meiose feminina. Focando nas células germinativas, conseguimos identificar candidatos para pesquisas futuras. Embora tenhamos encontrado vários desafios com a validação e possíveis efeitos fora do alvo, as percepções obtidas informarão investigações futuras e ajudarão a descobrir os mecanismos subjacentes da meiose.

Nossas descobertas abrem portas para a exploração contínua dos fatores genéticos em jogo durante a meiose, particularmente na identificação de componentes estruturais essenciais para o funcionamento celular adequado no oócito em desenvolvimento. Os acertos e categorias estabelecidos através dessa triagem fornecerão uma base para estudos futuros na área, avançando nossa compreensão da complexidade da meiose e sua regulação genética.