NanoPlex: Uma Nova Maneira de Ver Células

A microscopia de fluorescência é uma ferramenta super usada na biologia celular. Ela ajuda os cientistas a ver partes específicas das células ou tecidos usando cores especiais de luz. Muitas vezes, os cientistas conseguem olhar para múltiplos alvos ao mesmo tempo usando cores diferentes. Isso é útil quando estão estudando amostras biológicas complexas.

#O Básico da Microscopia de Fluorescência

Na microscopia de fluorescência, os cientistas usam corantes especiais que brilham sob certas luzes. O jeito mais comum de ver diferentes cores é usando quatro canais: azul, verde, vermelho e vermelho profundo. Para ver múltiplos alvos em uma amostra, os cientistas geralmente usam um método chamado imunofluorescência indireta (IF). Esse método depende de dois tipos de anticorpos.

1. Anticorpos Primários (1.Abs): Esses se ligam a alvos específicos na amostra.
2. Anticorpos Secundários (2.Abs): Esses estão ligados a um corante fluorescente e se ligam aos anticorpos primários.

Para observar três alvos diferentes em uma amostra, por exemplo, os cientistas precisam de três anticorpos primários de três espécies diferentes. Assim, conseguem anexar os anticorpos secundários especificamente a cada anticorpo primário.

#Desafios na Multiplexação

Embora esse método tenha sido útil, ele tem suas limitações. Às vezes, os cientistas precisam observar um número maior de alvos de uma só vez, especialmente em estudos detalhados como observar proteínas em células únicas.

No passado, alguns cientistas tentaram visualizar seis alvos removendo anticorpos usando métodos químicos. Isso foi feito através de processos como desnaturação química ou fotodesvanecimento, permitindo visualizar mais de 10 alvos. Porém, esses métodos podiam danificar a estrutura das células.

Abordagens mais recentes têm explorado o uso de tipos especiais de DNA para marcar sinais, permitindo uma imagem em áreas maiores. Esses métodos permitem estudos maiores, mas também podem trazer desafios, como redução na precisão em localizar moléculas. Assim, os cientistas precisam de novas técnicas que mantenham a integridade das amostras enquanto permitem a imagem de múltiplos alvos.

#Avanços na Microscopia de Super-Resolução

A microscopia de super-resolução é uma técnica mais nova que oferece detalhes melhores. Ela permite que os cientistas vejam mais alvos simultaneamente do que os métodos tradicionais. Uma das técnicas mais conhecidas é chamada Exchange-PAINT. Nesse método, anticorpos ou outras ferramentas de ligação são ligados a DNA de cadeia simples (ssDNA). Cada ssDNA serve como uma etiqueta única, permitindo que os cientistas identifiquem alvos com precisão.

Desenvolvimentos recentes permitiram que pesquisadores visualizassem até 30 alvos diferentes em uma amostra usando uma técnica mais avançada chamada SUM-PAINT. No entanto, essas técnicas podem ser complicadas e exigem equipamentos e expertise especializadas.

#Uma Nova Abordagem: NanoPlex

Para ajudar a simplificar o processo de imagem de múltiplos alvos, um novo método chamado NanoPlex foi desenvolvido. Esse método utiliza nanocorpos secundários engenheirados (2.Nbs) que podem se ligar aos anticorpos primários de um jeito simples. A tecnologia pode ser usada tanto em microscópios de luz normais quanto em técnicas avançadas de super-resolução como dSTORM ou STED.

A chave do NanoPlex é que ele não depende de tratamentos agressivos que podem danificar as células. Em vez disso, usa métodos suaves para remover sinais fluorescentes.

#Molécula Fotolábil: OptoPlex

O primeiro método dentro do NanoPlex, chamado OptoPlex, usa uma molécula sensível à luz. Quando essa molécula é iluminada com um comprimento de onda específico de luz, ela libera seu grupo fluorescente. Isso permite que os cientistas apaguem rapidamente e seletivamente sinais em regiões de interesse sem prejudicar a amostra.

Isso é especialmente útil porque permite um estudo detalhado sem danos extensivos à estrutura celular. Depois de apagar um sinal, os cientistas podem adicionar mais anticorpos e repetir o processo de imagem.

#Cleavage Enzimático: EnzyPlex

O segundo método é chamado EnzyPlex. Essa abordagem usa uma enzima protease específica que cliva um conector ligado ao fluoróforo. Os cientistas descobriram que, ao usar essa enzima, conseguem remover efetivamente sinais fluorescentes dos nanocorpos sem muito dano ao espécime.

Nos testes, o EnzyPlex atingiu alta eficiência na remoção de sinais, permitindo que as células fossem imaginadas várias vezes em curtos períodos. Esse método também é mais fácil de implementar, já que a enzima pode funcionar sob diversas condições.

#Química Redox: ChemiPlex

Por último, existe o método ChemiPlex, que é o mais simples dos três. Ele usa uma reação química para quebrar uma ligação entre o nanocorpo e a etiqueta fluorescente. Um agente redutor é aplicado, resultando na rápida e uniforme remoção de sinais em múltiplos alvos.

O ChemiPlex se mostrou eficiente e uniforme em suas capacidades de remoção de sinais, permitindo imagens de alta qualidade mesmo após vários ciclos.

#Alcançando Imagens Versáteis com NanoPlex

Com suas três abordagens, o NanoPlex permite que os cientistas imaginem muitos alvos em uma única amostra sem a necessidade de tratamentos agressivos. Isso o torna um método versátil aplicável em várias áreas, desde biologia básica até pesquisa médica avançada.

#Experimentando com Neurônios

Para demonstrar as capacidades do NanoPlex, os cientistas realizaram experimentos em neurônios hipocampais primários. Eles conseguiram visualizar 21 proteínas diferentes aplicando o método ChemiPlex de uma maneira simples. Isso incluiu olhar para proteínas envolvidas em sinapses, estruturas de filamentos e outras partes celulares.

Estudando esses neurônios, os pesquisadores puderam analisar o comportamento das proteínas sinápticas e as interações entre elas. Eles conseguiram até examinar como certos tratamentos afetaram a localização e interação dessas proteínas.

#Correlacionando Interações de Proteínas

Em outro experimento, os cientistas se concentraram em entender as relações entre nove proteínas sinápticas. Ao examinar sua co-localização em sinapses excitatórias e inibitórias, eles puderam avaliar como as proteínas interagiam entre si.

Eles descobriram que certas proteínas, como alfa-Sinucleína e Sinapsina-1, tinham correlações fortes, indicando seus papéis nas funções sinápticas. Após testes com 1,6-hexanodiol, conhecido por interromper interações específicas, eles observaram mudanças em como essas proteínas se correlacionavam. Isso sugeriu um nível mais profundo de entendimento sobre como as proteínas sinápticas funcionam e interagem dentro das células.

#Conclusão

Em resumo, o NanoPlex oferece uma solução valiosa para cientistas que buscam visualizar múltiplos alvos em células. Seus métodos suaves de remoção de sinais levam a uma qualidade de imagem melhor com dano mínimo. À medida que a necessidade por técnicas de imagem avançadas cresce, métodos como o NanoPlex podem abrir caminho para descobertas inovadoras na biologia celular.

Ao tornar a imagem multiplex acessível a muitos laboratórios, essa nova estratégia tem o potencial de expandir nosso entendimento sobre sistemas biológicos complexos. A capacidade de visualizar inúmeros alvos simultaneamente será fundamental em várias áreas, desde pesquisa até diagnósticos clínicos.