Avanços em Técnicas de Biologia Sintética

A biologia sintética é um ramo da ciência que mistura biologia e engenharia. Ela se concentra em criar novas partes biológicas, dispositivos e sistemas ou reformular sistemas biológicos existentes para propósitos úteis. Um dos principais objetivos é montar pedaços de DNA padronizados de forma eficiente e sustentável.

#Clonagem Golden Gate

Um método popular na biologia sintética é chamado de clonagem Golden Gate. Essa técnica usa enzimas específicas para cortar e unir o DNA. Ela permite que os cientistas combinem diferentes partes de DNA de um jeito flexível. Cada parte pode representar uma função específica, como um promotor (que inicia a expressão gênica), uma sequência de código que dá instruções para fazer proteínas ou um terminador (que para a expressão gênica).

Com a clonagem Golden Gate, os pesquisadores conseguem criar uma biblioteca de partes reutilizáveis. Essa biblioteca pode ser usada rapidamente para construir novas construções de DNA que podem responder a várias perguntas de pesquisa. Esse método pode economizar tempo e dinheiro, já que só as partes essenciais precisam ser checadas quanto à precisão.

#Sistema de Clonagem Modular

Baseado na clonagem Golden Gate, foi desenvolvido um sistema chamado Clonagem Modular (MoClo). Esse sistema permite a montagem de várias unidades de transcrição (TUs) em estruturas de DNA maiores. Teoricamente, essas estruturas podem ser do tamanho que precisar. Os pesquisadores usam enzimas diferentes para a clonagem Golden Gate, cada uma produzindo "overhangs" específicos que ajudam a unir fragmentos de DNA.

Uma enzima, a SapI, ainda não foi muito utilizada, mas gera overhangs mais curtos. Isso pode ser útil ao criar certos tipos de construções de DNA, especialmente aquelas onde pequenas mudanças podem afetar significativamente como elas funcionam. Estudos recentes ajudaram a identificar os melhores overhangs para maximizar o sucesso da clonagem Golden Gate.

#Nossa Caixa de Ferramentas para Clonagem Golden Gate

Apresentamos uma caixa de ferramentas que simplifica o processo de clonagem Golden Gate usando esses overhangs curtos. Essa caixa inclui dois componentes principais: "In-Cloning" para construir unidades de transcrição e "Out-Cloning" para criar plasmídeos aceitadores quando necessário.

A caixa de ferramentas funciona com os padrões MoClo, mas também pode se adaptar a vários outros padrões. O método MoClo permite construir peças grandes de DNA após várias rodadas de clonagem. No entanto, às vezes, plasmídeos específicos são necessários para as aplicações do organismo alvo. O sistema Out-Cloning atende a essa necessidade criando plasmídeos aceitadores Golden Gate sob demanda.

#Culturas de Levedura e Bactérias

Nos nossos estudos, usamos células de levedura e bacterianas. Linhagens de levedura são cultivadas sob condições específicas, e vários meios são usados para apoiar seu crescimento. Bactérias, especialmente E. coli, também são cultivadas para propagar e armazenar DNA plasmidial. Ambos os tipos de células são cultivados em um ambiente controlado para garantir resultados de alta qualidade.

#Oligodeoxirribonucleotídeos e Síntese Gênica

Oligodeoxirribonucleotídeos são fragmentos curtos de DNA encomendados para pesquisa. Eles são sintetizados de acordo com designs específicos para atender às necessidades de um estudo. O processo de síntese gênica cria sequências mais longas a partir desses fragmentos. O design dessas sequências evita certos locais de reconhecimento que poderiam interferir na clonagem.

#Purificação de DNA

Depois de construir DNA plasmidial, é essencial purificar os produtos. Esse processo geralmente envolve métodos de purificação com esferas magnéticas. Seguimos protocolos padrão para extrair e purificar DNA. A verificação dos plasmídeos construídos costuma ser feita usando métodos de sequenciamento para garantir a precisão.

#Construindo Partes Básicas com a Montagem Gibson

Outro método para construir plasmídeos é chamado de montagem Gibson. Esse método une fragmentos de DNA em uma única reação. Ele requer condições específicas para as enzimas que realizam a união.

Com a montagem Gibson, os pesquisadores conseguem criar novos plasmídeos e verificá-los minuciosamente para garantir que as sequências de DNA desejadas estejam corretas.

#Clonagem de Partes Básicas

Criar partes básicas é essencial para a montagem de construções maiores. Usando técnicas como a ligação de extremidades lisas, podemos gerar partes de Nível 0 necessárias para uma montagem posterior em unidades de transcrição e outras estruturas.

#Processo de In-Cloning

A parte In-Cloning da nossa caixa de ferramentas visa construir partes básicas para uso na clonagem modular Golden Gate. O processo foca em garantir que essas partes possam ser montadas corretamente. Avaliamos o sucesso dessas montagens medindo o número de construções corretas geradas.

#Processo de Out-Cloning

O sistema Out-Cloning tem como objetivo criar plasmídeos aceitadores rapidamente. Ele organiza uma coleção de diferentes elementos de plasmídeo que podem ser combinados de forma flexível com base nas necessidades do usuário. Esse sistema é essencial para adaptar construções de DNA para suas aplicações pretendidas em diferentes organismos.

#Aplicação do Out-Cloning

O Out-Cloning permite que os pesquisadores construam plasmídeos que atendam às suas necessidades específicas de forma eficiente. Por exemplo, ao testar a produção de β-caroteno em levedura, criamos múltiplos plasmídeos que permitiram examinar diferentes partes do caminho envolvido na produção desse composto.

Ao transformar linhagens de levedura com esses plasmídeos, podemos observar quais configurações levam à produção bem-sucedida de β-caroteno. Essa abordagem é valiosa para a experimentação, proporcionando uma maneira de testar rapidamente várias combinações sem precisar construir construções complexas do zero toda vez.

#Benefícios das Caixas de Ferramentas In-& Out-Cloning

As caixas de ferramentas In-Cloning e Out-Cloning oferecem versatilidade e eficiência. Elas permitem construir bibliotecas de partes e possibilitam a montagem de unidades de transcrição. A redução dos tamanhos de fusão nas montagens é particularmente benéfica para aplicações que envolvem RNA não codificante, onde a estrutura é crucial para a funcionalidade.

A caixa de ferramentas In-Cloning usa os overhangs curtos fornecidos pela enzima SapI, minimizando o potencial de erros durante a união das partes de DNA.

Por outro lado, o Out-Cloning proporciona flexibilidade ao permitir a criação rápida de plasmídeos quando necessário, o que é essencial quando projetos de pesquisa podem mudar de direção ou requerer novas construções rapidamente.

#Resumo

Em resumo, a biologia sintética oferece oportunidades empolgantes para criar construções biológicas únicas. Usando técnicas como a clonagem Golden Gate e os sistemas que desenvolvemos, os pesquisadores podem montar eficientemente estruturas complexas de DNA.

Essa caixa de ferramentas promove experimentação rápida com construções de DNA, reduzindo substancialmente o tempo e os recursos muitas vezes necessários para tal pesquisa. À medida que a biologia sintética continua a avançar, esperamos que esses métodos e ferramentas desempenhem um papel vital em vários campos científicos, levando a novas descobertas e aplicações.