Nanotiming: Um Método Econômico para Mapear o Tempo de Replicação do DNA

Os cromossomos nas células eucarióticas duplicam de uma maneira específica. Essa ordem, conhecida como timing de replicação (RT), é importante pra manter a estrutura da cromatina, que é o material que forma os cromossomos. O RT tá ligado a como os genes estão organizados no espaço e quão ativos eles são durante o processo de duplicação.

Os métodos atuais pra acompanhar o RT geralmente observam as mudanças no número de cópias de DNA ou o uso de nucleotídeos especiais durante a Fase s, que é a parte do ciclo celular onde o DNA é replicado. A maioria desses métodos precisa sincronizar as células ou agrupá-las com base no progresso da fase S, o que complica a preparação das amostras. Além disso, os procedimentos de sincronização das células podem interferir no processo de replicação do DNA.

Um método chamado análise de frequência de marcadores (MFA)-seq pode medir diretamente quantas cópias de sequências de DNA estão presentes em células que estão se dividindo ativamente, mas ele tem uma resolução limitada devido ao número de células que estão replicando a qualquer momento. Também, as técnicas de mapeamento de RT existentes podem ser caras. Por exemplo, mapear o RT de um pequeno genoma de levedura pode custar até $1.000 em recursos.

#Apresentando o Nanotiming

Recentemente, novos processos foram desenvolvidos pra usar um nucleosídeo especial, 5-bromo-2'-deoxiuridina (BrdU), pra acompanhar a replicação de DNA usando uma técnica chamada sequenciamento por nanopore. Em várias células eucarióticas, o número de trifosfato de desoxitimidina (dTTP) aumenta durante a fase S. Isso levou à ideia de usar a quantidade de BrdU encontrada nas leituras do sequenciamento por nanopore pra estimar o RT. A premissa é que mudanças nos níveis de BrdU podem mostrar como o nível de dTTP muda ao longo da fase S. Espera-se que haja menos incorporação de BrdU em regiões que replicam mais tarde comparadas àquelas que replicam mais cedo.

O processo, chamado Nanotiming, permite que os pesquisadores marquem células com BrdU por um único tempo de duplicação, e então quantifiquem o BrdU nas leituras do genoma via nanopore. Isso fornece perfis de RT de alta resolução sem precisar de classificação ou sincronização das células, o que reduz drasticamente os custos para cerca de $70 por perfil quando várias amostras são sequenciadas juntas. Esse método consegue alinhar de forma precisa longas leituras de nanopore a sequências altamente repetitivas, dando um perfil completo de RT de ponta a ponta do genoma.

#Metodologia do Nanotiming

Pra testar esse método, os pesquisadores começaram com uma espécie de levedura conhecida como S. cerevisiae, que é usada pra estudar a replicação de DNA eucariótico. Eles usaram uma cepa especial de levedura que permite uma eficiente incorporação de BrdU. Várias concentrações de BrdU foram testadas pra encontrar o nível mais eficaz pra capturar o aumento de dTTP durante a fase S.

Depois de expor a levedura a diferentes concentrações de BrdU por um tempo de duplicação, os resultados mostraram níveis variados de BrdU entre as leituras de nanopore. As melhores concentrações foram entre 5 a 20 µM de BrdU, já que concentrações mais altas levaram a uma saturação de BrdU no DNA. Os pesquisadores então compararam os níveis médios de BrdU aos números relativos de cópias obtidos pelo sort-seq e encontraram uma forte correlação positiva, confirmando que níveis mais baixos de incorporação de BrdU indicam regiões que replicam mais tarde.

Ao manter uma concentração consistente de BrdU, os pesquisadores garantiram que as células de levedura não sofressem interrupções no tempo de replicação. O conteúdo médio de BrdU resultante se aproximou muito dos perfis obtidos por sort-seq, demonstrando que o Nanotiming poderia criar mapas de RT detalhados do genoma da levedura sem a necessidade de preparação complexa das amostras.

#Aplicações do Nanotiming

Os pesquisadores testaram o Nanotiming em várias cepas mutantes de levedura pra ver como a ausência de certos reguladores de replicação afetava o RT. Eles mapearam com sucesso o RT em cepas sem proteínas regulatórias importantes, revelando que a ausência de Ctf19 fez algumas regiões replicarem mais tarde, enquanto a perda de Rif1 fez alguns telômeros replicarem mais cedo.

Curiosamente, ao estudar os telômeros dos cromossomos de levedura, eles descobriram que nem todos os telômeros foram afetados da mesma forma pela ausência de Rif1. O método mostrou que Rif1 regula diretamente apenas um subconjunto de telômeros, especialmente aqueles com sequências subteloméricas específicas.

Em outro aspecto de seus testes, os pesquisadores analisaram o comprimento de telômeros individuais junto com seu tempo de replicação. Eles não encontraram uma conexão clara entre o comprimento do telômero e o tempo de replicação, exceto por uma leve tendência em uma cepa mutante específica. Os telômeros mostraram um tempo de replicação tardio em geral, mas alguns telômeros tiveram tempos de replicação mais cedo, independentemente de seus comprimentos.

#Eficiência de Custo do Nanotiming

Uma vantagem significativa do Nanotiming é sua relação custo-benefício e potencial para aplicações em larga escala. Usando sequenciamento multiphase, várias amostras podem ser processadas ao mesmo tempo, reduzindo drasticamente o custo por perfil genômico. Essa acessibilidade poderia permitir que muitos laboratórios realizassem estudos de RT que antes eram limitados devido a restrições de recursos.

Em comparação, métodos tradicionais exigem mais recursos e podem ser muito mais caros. A habilidade de realizar muitas análises de RT em uma única execução com custos mínimos torna o Nanotiming uma escolha prática para os pesquisadores.

#Conclusão: O Futuro do Nanotiming

O Nanotiming representa um avanço significativo no campo dos estudos de replicação cromossômica. Ele simplifica o processo de obtenção de perfis de RT de alta resolução e expande o potencial para análises em larga escala. O método traz clareza às complexidades da replicação em telômeros individuais e pode levar a novas percepções sobre os mecanismos que regem a integridade dos cromossomos.

No geral, essa nova abordagem não só melhora nosso entendimento de como os cromossomos se duplicam, mas também abre caminho pra aplicações mais amplas e pesquisas sobre os mecanismos de replicação de vários organismos. Com sua facilidade de uso e baixo custo, o Nanotiming tá prestes a se tornar uma ferramenta amplamente adotada no estudo da replicação de DNA e dinâmicas da cromatina.