Avanços na Edição Genética com Células-Tronco

As células-tronco são células especiais no nosso corpo que podem se transformar em vários tipos diferentes de células. Elas são importantes para a pesquisa porque ajudam a entender doenças e testar novos medicamentos. Um tipo de célula-tronco é chamado de células-tronco pluripotentes humanas (HPSCs), que podem se tornar quase qualquer tipo de célula no corpo. Os cientistas estão usando essas células para estudar doenças e procurar novos tratamentos.

Edição genética é um método usado pelos cientistas para mudar o DNA nas células. Uma ferramenta popular para edição genética se chama CRISPR/Cas9. Essa ferramenta permite que os pesquisadores removam ou mudem genes específicos dentro do DNA. Usando o CRISPR/Cas9 em hPSCs, os cientistas podem criar modelos de doenças para entender melhor como funcionam e testar possíveis tratamentos.

#O que é Knockout Genético?

Knockout genético é um método que os pesquisadores usam para entender o que acontece quando um gene específico é desligado ou removido. Isso é importante porque alguns genes podem causar doenças quando não funcionam bem. Ao criar um knockout em hPSCs, os cientistas podem observar como a ausência de um gene afeta as células. Isso pode levar a novas ideias sobre como as doenças se desenvolvem e como podem ser tratadas.

O CRISPR/Cas9 é frequentemente usado para criar knockouts genéticos. O sistema atinge uma parte específica do DNA para fazer cortes, levando a mudanças no gene. Quando o DNA tenta se reparar, pode resultar em pequenas mudanças, conhecidas como inserções ou deleções (INDELs), que podem atrapalhar a função do gene.

#Desafios na Edição Genética em Células-Tronco

Ao usar o CRISPR/Cas9 em hPSCs, os cientistas enfrentaram alguns desafios. Nos primeiros experimentos, a eficiência do knockout genético era bem baixa-só cerca de 1-2%. Isso aconteceu porque hPSCs geralmente resistem a mudanças no seu DNA, tornando difícil para os pesquisadores editarem os genes com sucesso.

Com o tempo, os cientistas tentaram várias maneiras de melhorar esse processo. Eles estudaram como entregar melhor a ferramenta CRISPR nas células, projetaram guias mais eficazes e experimentaram diferentes métodos para fazer as células aceitarem as mudanças. Algumas novas estratégias envolviam usar diferentes formas de CRISPR, como os complexos de ribonucleoproteínas Cas9 (RNP) ou versões modificadas do Cas9 que podem ser ativadas por um remédio chamado doxiciclina (Dox).

#O Sistema hPSCs-iCas9 Otimizado

Nesta pesquisa, foi desenvolvido um novo sistema chamado sistema hPSCs-iCas9 otimizado. Esse sistema melhorou significativamente a eficiência do knockout genético em hPSCs. Os pesquisadores ajustaram vários fatores, como como as células foram tratadas e o momento em que as ferramentas de edição foram introduzidas.

Depois de fazer esses ajustes, eles conseguiram uma eficiência de INDEL impressionante de 82% a 93% em experimentos de knockout genético. Isso significa que uma porcentagem muito maior das hPSCs teve os genes removidos com sucesso em comparação com métodos anteriores.

#Abordando Desafios no Design de sgRNA

Uma parte crucial do uso do CRISPR/Cas9 é projetar os RNAs guia (SgRNAs) que dizem ao sistema onde cortar o DNA. Muitos recursos estão disponíveis online para ajudar a projetar esses sgRNAs, mas existem desafios. Nem todas as previsões dessas ferramentas são precisas, o que pode levar à escolha de sgRNAs ineficazes.

Para resolver isso, os pesquisadores testaram vários sgRNAs para ver como se saíram em experimentos reais em comparação com suas pontuações previstas. Eles descobriram que algumas ferramentas de design eram mais confiáveis que outras, ajudando-os a escolher melhores sgRNAs em experimentos futuros.

#Verificando a Expressão de Proteínas

Depois de usar sgRNAs para criar células knockout, é essencial verificar se as proteínas-alvo ainda estão sendo produzidas. Essa etapa é importante porque, às vezes, mesmo com a edição do DNA, a proteína pode ainda estar presente por várias razões, como splicing alternativo ou outros mecanismos celulares.

Para garantir que os sgRNAs corretos foram escolhidos, os pesquisadores usaram uma técnica chamada Western blotting para detectar as proteínas nas células editadas. Assim, eles puderam ver quais sgRNAs foram eficazes em remover as proteínas-alvo e quais não foram.

#Processo Passo a Passo da Pesquisa

#1. Preparando Células-Tronco

Os pesquisadores usaram tipos específicos de hPSCs, que foram cultivadas em condições controladas. As células eram regularmente checadas para garantir que estavam saudáveis e livres de contaminação.

#2. Criando as Linhas hPSCs-iCas9

O próximo passo foi introduzir o sistema Cas9 nas hPSCs. Isso foi feito inserindo um pedaço especial de DNA que contém as instruções para a proteína Cas9 em um local seguro no genoma da célula-tronco. Após a introdução, as células foram selecionadas com base na sua capacidade de sobreviver e carregar o novo gene.

#3. Projetando sgRNAs

Os pesquisadores projetaram vários sgRNAs direcionando diferentes genes com base nas previsões das ferramentas de design. Eles garantiram que esses sgRNAs fossem adequados para as tarefas de edição genética que eles pretendiam realizar.

#4. Nucleofecção

A nucleofecção foi o método escolhido para entregar os sgRNAs nas hPSCs. Essa técnica usa impulsos elétricos para ajudar os sgRNAs a entrarem nas células de forma mais eficaz.

#5. Testando e Melhorando

Após a nucleofecção, os pesquisadores verificaram a eficiência das edições genéticas. Eles repetiram esse processo várias vezes com parâmetros ajustados para ver se poderiam obter resultados ainda melhores. A cada rodada de testes, aprenderam mais sobre o que funcionava e o que não funcionava.

#Diferenciando Células-Tronco em Cardiomiócitos

Uma vez que o sistema otimizado estava funcionando, os pesquisadores focaram em diferenciar as hPSCs mutantes em cardiomiócitos (células do coração). Essa etapa é crucial para modelar doenças cardíacas, pois permite o estudo dos efeitos da doença em tipos celulares específicos.

Os pesquisadores seguiram um protocolo específico para incentivar as hPSCs a se converterem em cardiomiócitos. Eles observaram uma alta pureza de células de cardiomiócitos, garantindo que os modelos criados fossem adequados para estudar doenças cardíacas.

#Disfunção mitocondrial na Modelagem de Doenças

Os pesquisadores focaram em uma doença específica chamada síndrome de Barth, que é conhecida por causar disfunção mitocondrial devido a mutações genéticas específicas. Usando seu sistema hPSCs-iCas9 para remover o gene TAZ, eles criaram um modelo para estudar os efeitos da perda desse gene nas células do coração.

Uma vez que os cardiomiócitos knockout foram criados, eles avaliaram como as células funcionavam. Eles descobriram que essas células knockout apresentaram problemas mitocondriais significativos, que são conhecidos por ocorrer em pacientes com síndrome de Barth.

#Comparação de Métodos de Entrega

Enquanto estudavam a eficiência da edição genética em cardiomiócitos, os pesquisadores testaram diferentes métodos para entregar os componentes do CRISPR. Eles descobriram que os métodos tradicionais de lipossomas não deram bons resultados nessas células diferenciadas.

Essa descoberta sugere que os métodos de entrega populares atuais podem não ser adequados para todos os tipos celulares, e mais otimizações são necessárias para uma edição genética eficaz em células especializadas como os cardiomiócitos.

#Validando a Eficiência da Edição

Os pesquisadores também queriam garantir que seus métodos de edição genética eram precisos. Eles compararam três ferramentas de análise diferentes para ver qual delas fornecia os melhores resultados na compreensão da eficiência de suas edições. Eles descobriram que algumas ferramentas funcionavam melhor que outras, permitindo que obtivessem insights sobre como certos sgRNAs se saíram.

#Aplicações Práticas e Direções Futuras

Os avanços feitos pelos pesquisadores na edição genética de hPSCs representam um passo significativo na área de medicina regenerativa. Essa abordagem otimizada para knockout genético pode levar a melhores modelos para estudar doenças, ajudando a testar novos medicamentos de forma mais eficiente.

Olhando para o futuro, essa plataforma pode ser expandida para outros tipos de modificações genéticas, como mutações pontuais direcionadas ou deleções maiores, o que poderia aumentar ainda mais sua utilidade na pesquisa genética.

À medida que o campo continua a crescer, os pesquisadores terão a capacidade de entender melhor a complexidade das doenças genéticas e desenvolver novas estratégias terapêuticas para combatê-las. O objetivo é tornar as estratégias avançadas de edição genética acessíveis e práticas para uma ampla gama de aplicações científicas.

#Conclusão

A pesquisa descrita fez progressos consideráveis em melhorar os métodos de edição genética em hPSCs. Ao desenvolver o sistema hPSCs-iCas9 otimizado, os cientistas abriram novas portas para estudar doenças e testar tratamentos. Com esforço e refinamento contínuos, essa tecnologia pode se tornar uma ferramenta crítica na luta contra vários distúrbios genéticos, levando a melhores resultados de saúde.