Il ruolo cruciale del flusso sanguigno nello sviluppo del cuore

Il cuore dei mammiferi inizia come un semplice tubo e si sviluppa in una complessa struttura a quattro camere. Nei topi, questa trasformazione diventa evidente intorno al giorno 9.5 dello sviluppo embrionale. Durante questo periodo, alcune zone del tubo primario del cuore crescono più rapidamente, formando i muscoli funzionanti del cuore. Nel frattempo, altre aree si sviluppano in modo diverso, formando parti come il tratto di efflusso e il canale atrioventricolare.

Tra i giorni 9.5 e 10.5, le cellule in regioni specifiche del cuore attraversano un processo chiamato transizione endoteliale-mesenchimale (EMT), che aiuta a creare strutture conosciute come cuscinetti endocardiali. Questi cuscinetti sono importanti perché giocano un ruolo nella divisione delle camere cardiache e nella formazione delle valvole. Problemi in questi cuscinetti possono portare a difetti cardiaci congeniti negli esseri umani.

#Vie di Segnalazione nello Sviluppo del Cuore

Diverse vie di segnalazione lavorano insieme per guidare come si forma il cuore e come cambiano le cellule durante questo processo. Ad esempio, una proteina chiamata BMP2 nel canale atrioventricolare e nel tratto di efflusso attiva un'altra proteina chiamata TBX2, che poi attiva TGFβ2. Queste proteine aiutano a incoraggiare l'EMT aumentando l'espressione di Snail1.

La segnalazione Notch, un'altra via vitale, è anche necessaria per l'EMT. Al giorno 9.5, il dominio intracellulare di Notch1 (NICD) è più attivo nelle cellule endocardiali del canale atrioventricolare e del tratto di efflusso. In aree come i ventricoli, NICD appare più limitato. La segnalazione Notch attiva Snail2, diminuendo l'espressione di una proteina chiamata VE-cadherin, necessaria per l'adesione cellulare. Se la segnalazione Notch viene interrotta, l'EMT nel canale atrioventricolare si ferma, dimostrando il ruolo essenziale di questa via nella formazione del cuore.

Anche se sappiamo che Notch è significativo nello sviluppo del cuore, le ragioni esatte per cui Notch si attiva specificamente nelle aree che stanno subendo EMT sono ancora poco chiare. Diversi recettori e ligandi Notch, come Notch1, Dll4 e Jag1, vengono espressi in queste regioni all'inizio dell'EMT. Mentre Notch1 è distribuito uniformemente nell'endocardio, Dll4 si trova principalmente nell'endocardio ventricolare. Jag1 mostra alti livelli nel miocardio, ma solo poche cellule endocardiali nel canale atrioventricolare lo esprimono.

Quando i ricercatori eliminano Dll4 da tutte le cellule endoteliali, notano una mancanza di marcatori tipici per l'EMT e un'assenza di cuscinetti atrioventricolari. Tuttavia, non è ancora certo se questa mancanza sia dovuta esclusivamente alla perdita della segnalazione Dll4-Notch o se sia causata da problemi nella circolazione sanguigna legati all'eliminazione di Dll4. Questo mostra che la nostra attuale comprensione dell'attivazione della segnalazione Notch nell'endocardio è incompleta.

#Il Ruolo dei Canali Ioni Meccanico-Sensibili

Studi sugli embrioni di pesce zebra rivelano che specifici canali ionici aiutano a controllare l'espressione di Notch1b nell'endocardio in risposta ai cambiamenti del flusso sanguigno. Tuttavia, nei topi in via di sviluppo, Notch1 è espressa uniformemente nell'endocardio, indipendentemente dalla sua presenza limitata in altre aree come il canale atrioventricolare e il tratto di efflusso.

Per investigare come il flusso sanguigno influisce sull'attivazione della segnalazione Notch, gli scienziati hanno bloccato il battito cardiaco negli embrioni di topo in via di sviluppo utilizzando un farmaco chiamato dofetilide. Questo farmaco interrompe selettivamente una corrente nelle cellule muscolari cardiache. Dopo aver fermato il battito, hanno scoperto che l'attivazione di Notch nell'endocardio dipende da Dll4. Una diminuzione di Dll4 nell'endocardio crea una condizione che consente l'attivazione di Notch in risposta a un aumento del flusso sanguigno. L'alta Tensione di taglio nelle aree in cui si sviluppano le valvole modifica la struttura della membrana cellulare, attivando le vie che promuovono la segnalazione Notch, anche senza una forte stimolazione del ligando.

Questi risultati suggeriscono che le forze meccaniche del flusso sanguigno giocano un ruolo cruciale nello sviluppo del cuore. Potrebbero aiutare a spiegare varie malattie cardiache congenite che originano da problemi endocardiali.

#Schemi di Attivazione di Notch nell'Endocardio

Sebbene Dll4, Jag1 e Notch1 siano conosciuti come attori chiave nell'attivazione di Notch nell'endocardio, la relazione tra l'attività di Notch e l'espressione dei ligandi in aree specifiche non è stata esaminata a fondo. Per esplorarlo, i ricercatori hanno studiato l'espressione di NICD, Dll4 e Jag1 nell'endocardio in diverse fasi.

Durante le fasi iniziali dello sviluppo, Dll4 e NICD appaiono uniformemente nell'endocardio. Tuttavia, al giorno 9.5, emergono schemi distinti, dividendo l'endocardio in tre tipi in base ai livelli di Dll4 e NICD. Tipo I ha alte quantità di Dll4 e NICD e non subisce EMT. Tipo II ha alto NICD ma basso Dll4, il che significa che queste cellule subiranno EMT. Tipo III ha bassi livelli di entrambi e non subisce EMT.

Ricerche precedenti hanno mostrato che l'EMT dipende da Dll4. Per indagare ulteriormente il ruolo di Dll4, gli scienziati l'hanno eliminato specificamente nelle cellule endoteliali. Hanno scoperto che questa eliminazione ha quasi completamente rimosso NICD nelle regioni dove Dll4 era tipicamente alto, indicando un forte legame tra Dll4 e l'attivazione di Notch. Tuttavia, in aree come il canale atrioventricolare e il tratto di efflusso, NICD era ridotto ma non completamente assente, suggerendo che anche fattori diversi potrebbero influenzare l'attivazione di Notch lì.

#L'Importanza del Flusso Sanguigno

Studi precedenti sui pesci zebra hanno indicato che le contrazioni cardiache influenzano la segnalazione Notch nell'endocardio. Per verificare se il flusso sanguigno regola Notch nei cuori dei topi in via di sviluppo, i ricercatori hanno trattato topi incinta con dofetilide al giorno 9.5 e poi hanno osservato gli embrioni a vari punti temporali dopo il trattamento.

Bloccare il flusso sanguigno ha portato a una perdita di NICD nel tratto di efflusso prossimale e nell'endocardio del canale atrioventricolare, senza cambiare i livelli globali del recettore Notch1. I livelli di NICD sono tornati alla normalità dopo la ripresa del flusso sanguigno, mostrando una relazione diretta tra il flusso e l'attivazione di Notch. Non ci sono stati cambiamenti significativi nei livelli di Dll4 e Jag1 dopo il trattamento. Diversi marcatori associati all'EMT sono diminuiti nell'endocardio del canale atrioventricolare quando il flusso sanguigno è stato interrotto. Tuttavia, i livelli di NICD nell'aorta dorsale sono rimasti invariati.

Quando hanno studiato embrioni con attività cardiaca ridotta a causa di cambiamenti genetici, anche questi embrioni mostravano livelli più bassi di NICD, confermando che la diminuzione del flusso sanguigno riduce l'attivazione di Notch nell'endocardio. Altri trattamenti che hanno fermato i battiti cardiaci hanno avuto effetti simili sull'attivazione di Notch.

Per assicurarsi che i bassi livelli di ossigeno non stessero influenzando Notch, i ricercatori hanno testato embrioni che mancavano di globuli rossi ma avevano ancora livelli normali di NICD. Hanno anche coltivato embrioni in condizioni di alta ossigeno mentre usavano dofetilide, confermando che il basso ossigeno non era la causa della perdita di NICD.

Questi risultati suggeriscono collettivamente che l'attivazione di Notch e l'EMT nell'endocardio dei cuscinetti dipendono in modo significativo dalle forze meccaniche generate dal flusso sanguigno.

#Meccanismi dietro l'Attivazione di Notch

Poiché NICD è stato rapidamente perso dopo l'interruzione del flusso sanguigno, i ricercatori hanno pensato che modifiche post-traduzionali come la fosforilazione potrebbero svolgere un ruolo chiave. Proteine come PKC, AKT e ERK sono state conosciute per cambiare in risposta alla tensione di taglio. Ulteriori studi hanno rivelato che la fosforilazione di PKC e AKT è diminuita dopo il trattamento con dofetilide, mentre ERK non è stato rilevato nell'endocardio.

Quando i ricercatori hanno inibito AKT con wortmannin, non hanno fermato l'attivazione di Notch, mentre bloccare PKC con staurosporina ha effettivamente arrestato l'attivazione. Questo indica che PKC è essenziale per la regolazione di Notch. Come ulteriore prova, l'eliminazione di alcuni geni PKC ha portato a livelli ridotti di NICD e a un aumento dei difetti cardiaci.

Quando gli scienziati hanno trattato topi incinta con un attivatore di PKC, sono stati in grado di invertire gli effetti negativi del trattamento con dofetilide sull'attivazione di NICD, confermando che l'attività di PKC è cruciale per la segnalazione Notch nell'endocardio.

È stata anche indagata la relazione tra PKC e mTORC2. L'eliminazione di un componente importante di mTORC2 ha portato a una riduzione dell'attivazione di PKC e AKT e a livelli ridotti di NICD nell'endocardio. Questo indica che mTORC2 gioca un ruolo nella via di segnalazione che collega il flusso sanguigno e l'attivazione di Notch.

#Effetti della Tensione di Taglio sulla Struttura della Membrana

In altri studi, gli scienziati hanno scoperto che il flusso sanguigno aumenta le strutture cellulari chiamate caveole all'interno delle cellule endoteliali. Queste strutture sono ricche di colesterolo e giocano un ruolo nella segnalazione. Quando i ricercatori hanno esposto gli embrioni a dofetilide, hanno notato che le caveole si spostavano dalla superficie cellulare ai siti di adesione, impattando le vie di segnalazione collegate a PKC e Notch.

Trattare gli embrioni con colesterolo ha aiutato a mantenere le caveole sulla superficie cellulare, migliorando l'attivazione di NICD. Questo suggerisce che il colesterolo e le caveole giochino un ruolo essenziale nel modo in cui la tensione di taglio influisce sulla segnalazione di Notch.

#Interazioni Tra Genetica e Ambiente

Le cause di molti difetti cardiaci congeniti sono complesse e spesso non sono collegate a singoli fattori genetici. I ricercatori hanno esplorato come ridurre la quantità di Notch1 possa interagire con fattori che disturbano il normale flusso sanguigno verso l'endocardio. Hanno incrociato topi eterozigoti per Notch1 con topi wildtype e poi li hanno trattati con dofetilide. La combinazione ha portato a un aumento significativo dei difetti cardiaci, indicando che i fattori genetici e ambientali possono interagire.

#Conclusione

Questo studio rivela che il flusso sanguigno gioca un ruolo cruciale nell'attivazione della segnalazione Notch durante lo sviluppo del cuore nei mammiferi. L'alta tensione di taglio in specifiche regioni cardiache aiuta a guidare la formazione di strutture necessarie per un corretto funzionamento del cuore. Comprendere questi meccanismi è essenziale perché possono portare a intuizioni sulle malattie cardiache congenite che sorgono quando questi processi vanno storti. Esaminando le interazioni tra flusso sanguigno, vie di segnalazione e fattori genetici, i ricercatori possono iniziare a districare la complessa rete di influenze che portano a malformazioni cardiache.