Avanzamenti nella colorazione ORO per nematodi

L’Olio Rosso O (ORO) è una tintura usata per vedere e misurare il Grasso in piccoli esseri chiamati nematodi. Questo metodo aiuta gli scienziati a capire come il grasso viene immagazzinato e utilizzato in questi organismi. Tuttavia, molti dei modi per misurare il grasso con l'ORO possono portare a errori. Questi errori potrebbero dipendere dal fatto che guardiamo i campioni solo con i nostri occhi, dalla necessità che le persone cambino manualmente le impostazioni, o dall'uso di formati di immagine che modificano i valori che vogliamo misurare.

In genere, per vedere quanto dye è stato assorbito, gli scienziati guardano come la Luce passa attraverso il campione in diversi colori. Ad esempio, confrontano come la luce passa attraverso aree in cui l'ORO è chiaro e aree in cui assorbe luce. Ma ci possono essere errori in questo processo perché gli strumenti che usiamo per vedere i campioni possono reagire in modo diverso ai diversi colori, influenzati da come è impostata la camera.

Per lo più, i metodi funzionano bene per individuare grandi cambiamenti nell'uso del grasso. Tuttavia, i cambiamenti più piccoli possono essere persi o avere un valore sbagliato. Questo articolo parlerà di un nuovo metodo che migliora il modo in cui misuriamo il grasso con l'ORO, riducendo gli errori migliorando come catturiamo e analizziamo le immagini.

#Processo di Colorazione ORO

Il metodo di colorazione ORO inizia preparando una soluzione. Si inizia mescolando 0,5 grammi di polvere ORO in 100 millilitri di isopropanolo, che è un tipo di alcol. Questa miscela viene agitata per alcuni giorni. Una volta pronta, la soluzione viene filtrata per rimuovere eventuali parti solide, e poi mescolata con acqua purificata per creare una soluzione di lavoro che è il 60% ORO.

Dopo, i nematodi vengono fissati così che le loro strutture rimangano le stesse durante il processo di colorazione. Inizialmente, vengono lavati usando una soluzione salina speciale chiamata PBS. Dopo il lavaggio, i vermi vengono messi in un tubo e l'acqua viene rimossa. I nematodi vengono poi trattati con una soluzione di formaldeide per 30 minuti. Sottoposti a tre cicli di congelamento-scongelamento per prepararli alla colorazione. Infine, i vermi vengono disidratati usando isopropanolo.

Dopo che i vermi sono pronti, vengono colorati con la soluzione ORO per 30 minuti. Una volta finita la colorazione, vengono lavati di nuovo con PBS e messi in un medio di montaggio speciale prima di essere messi su un vetrino per l'imaging.

#Acquisizione delle Immagini

Per vedere chiaramente i nematodi e ottenere le loro immagini, viene utilizzato un setup specifico. Un microscopio avanzato con una lampada alogena e una camera speciale scatta le foto. Le immagini vengono catturate usando diversi canali di colore: uno per la luce normale, un altro per un filtro blu e un terzo per un filtro rosso. È importante che tutte le impostazioni-come l’intensità della luce e il tempo di esposizione-rimangano le stesse per tutte le immagini. Si fa anche attenzione a catturare immagini senza aree sovraesposte (sature).

Le immagini vengono salvate in un formato speciale per mantenere tutti i dettagli e le informazioni su come sono state scattate. Questo aiuta a garantire che tutti i dati necessari possano essere analizzati in seguito.

#Analisi delle immagini

Una volta scattate le immagini, vengono analizzate usando uno script specifico in un software chiamato Fiji. Questo processo è per lo più automatizzato, facilitando l'ottenimento dei risultati. L'utente apre un'immagine e segna un’area circolare per regolare il bilanciamento della luce. Quest'area non deve toccare i vermi e deve essere distante dai bordi dell'immagine.

Dopo aver segnato quest'area, il passo successivo è contornare i vermi. I contorni devono essere attenti a includere tutti i segnali rilevanti senza essere troppo stretti. Una volta disegnati i contorni, il software calcola automaticamente valori importanti come l'intensità del colorante all'interno dell'area delimitata.

I risultati vengono scritti in una tabella, con tutte le informazioni rilevanti su ciascuna immagine così che i dati possano essere ricondotti alle immagini originali. Le misurazioni e i contorni delle immagini vengono salvati per tenere traccia di tutto.

#Risultati e Discussione

Usare un sistema con una camera in scala di grigi aiuta a mantenere una risposta coerente ai diversi colori. Questo è importante perché cambiare il bilanciamento del bianco può falsare i risultati. Viene usato anche un fattore di correzione per garantire che le letture della luce che passa attraverso i canali blu e rosso siano accurate. Senza questa correzione, i valori potrebbero non riflettere realmente quanto colorante è assorbito dal grasso.

Un altro punto affrontato riguarda l’uso del disegno manuale dei contorni dei vermi invece di fare affidamento su programmi informatici per trovare automaticamente i bordi. Molti programmi per computer si basano su valori statistici, che possono variare molto quando si lavora con oggetti di dimensioni e intensità diverse. Pertanto, il contorno manuale aiuta a creare risultati più accurati.

Quando si misura quanto grasso è colorato dall'ORO, la lettura migliore viene dall’osservare la quantità totale di luce rilevata per ciascun verme, conosciuta come Densità integrata. Questo numero non dipende dalla dimensione dell'area marcata. Ci sono due modi per presentare i dati di assorbimento: in numeri assoluti o come rapporto rispetto alla dimensione del verme.

In generale, questo nuovo metodo per la colorazione e misurazione con ORO elimina molti potenziali errori, rendendolo affidabile per studiare sia cambiamenti significativi che minori nel modo in cui il grasso viene gestito nei nematodi.

#Conclusione

Il nuovo metodo per usare il colorante Olio Rosso O nei nematodi riduce notevolmente gli errori nella misurazione. Gli scienziati possono fidarsi di ottenere risultati accurati quando studiano il metabolismo lipidico. Questo può portare a migliori intuizioni su come questi piccoli organismi gestiscono il grasso, il che potrebbe avere implicazioni più ampie per comprendere la gestione del grasso in altre creature, compresi gli esseri umani.

In sintesi, una preparazione attenta, un'acquisizione di immagini coerente e tecniche di analisi affidabili contribuiscono a una migliore misurazione del contenuto di grasso nei nematodi usando l'ORO. Questo approccio segna un importante passo avanti nel campo, permettendo ai ricercatori di vedere più chiaramente i cambiamenti nell'immagazzinamento e nell'uso del grasso, fornendo loro una migliore comprensione del metabolismo lipidico in questi piccoli organismi.