Nuovo metodo di test per la peste suina africana
Si sta sviluppando uno strumento promettente per rilevare rapidamente l'ASF nei maiali.
Sekhar Kambakam, Julia Thomas, Suelee Robbe-Austerman, Karthik Shanmuganatham, Rachel Palinski
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Indice
La Peste Suina Africana (PSA) è una malattia virale che colpisce i maiali, sia domestici che selvatici. Questa malattia è causata da un virus conosciuto come il Virus della Peste Suina Africana (PSAV). Fa parte di un gruppo di virus noti per la loro struttura complessa. Il PSAV ha una grande quantità di materiale genetico, in particolare DNA a doppio filamento, e può produrre oltre 160 proteine diverse che lo aiutano a funzionare.
La PSA è nota per essere altamente contagiosa. Questo significa che se un maiale si infetta, può diffondersi rapidamente ad altri, creando problemi notevoli per gli allevatori di maiali. Il PSAV può essere trasmesso da maiale a maiale tramite contatto diretto, ma può anche sopravvivere all'esterno dei maiali per molto tempo. Può restare nell'ambiente, negli alimenti, sulle attrezzature o persino sui vestiti. Perciò, il virus può causare seri problemi per l'industria suinicola a livello globale.
I maiali infetti possono mostrare una varietà di sintomi. Spesso sviluppano alta febbre, possono diventare letargici, perdere l'appetito, vomitare, avere diarrea e persino soffrire di emorragie e difficoltà respiratorie. Nei casi in cui l'infezione è grave, i maiali possono morire rapidamente, a volte entro una settimana, e il tasso di mortalità può raggiungere il 100%.
Origini e Diffusione della PSA
Si pensa che la PSA sia iniziata nell'Africa subsahariana, dove il virus è ancora presente tra le popolazioni locali di maiali. Negli anni, ci sono stati focolai in Europa e nelle Americhe, anche se molti di questi sono stati poi controllati.
Un focolaio significativo è avvenuto in Georgia nel 2007, portando il virus a diffondersi tra le popolazioni di cinghiali nell'Europa orientale. Per oltre un decennio, la PSA è rimasta abbastanza contenuta fino a quando le misure di biosicurezza sono state violate, permettendo una rapida diffusione in Cina nel 2018. Questo focolaio ha avuto effetti drammatici, causando un collasso nell'industria suinicola del paese.
Nel 2021, il virus è stato rilevato sull'isola caraibica di Hispaniola, e questo focolaio è ancora in corso, il che solleva preoccupazioni per paesi come gli Stati Uniti. Per combattere questa minaccia, gli Stati Uniti hanno intensificato i loro sforzi per monitorare e controllare la PSA. Hanno implementato misure severe per prevenire il movimento di carne di maiale e prodotti correlati dai territori colpiti, nella speranza di proteggere la loro popolazione suinicola domestica.
La Necessità di una Diagnosi Efficace
Dato l'impatto serio della PSA, è fondamentale una rilevazione rapida e accurata. I metodi tradizionali come il QPCR (che sta per Reazione a Catena della Polimerasi Quantitativa) sono attualmente lo standard d'oro per diagnosticare il PSAV. Tuttavia, il qPCR richiede attrezzature costose, formazione speciale e configurazioni di laboratorio specifiche, rendendolo impraticabile per l'uso in aree con risorse limitate.
Metodi alternativi come RPA (Amplificazione della Polimerasi Ricombinante) e LAMP (Amplificazione Isotermica Mediata da Loop) sono stati sviluppati ma non eguagliano l'accuratezza del qPCR. È come cercare di acchiappare un animale veloce con una rete più lenta. La sfida sta nel creare test che siano buoni come il qPCR, ma abbastanza semplici da poter essere usati da chiunque, anche in aree remote.
CRISPR
Un Approccio Innovativo: TecnologiaRecentemente, una nuova tecnica chiamata CRISPR ha suscitato interesse in molti campi, incluso l'ingegneria genetica e la medicina. Questa tecnologia ha il potenziale di essere adattata per diagnosticare malattie, inclusa la PSA.
Combinando CRISPR con RPA, i ricercatori stanno cercando di sviluppare test più veloci e semplici che possano essere usati direttamente nei luoghi dove vengono tenuti i maiali. Questo approccio duale potrebbe aiutare gli allevatori a identificare rapidamente le infezioni e prevenire focolai più ampi.
Sviluppare un Nuovo Metodo di Test
In questa ricerca, gli scienziati si sono concentrati sulla creazione di un nuovo test per il PSAV utilizzando RPA abbinato alla tecnologia CRISPR. Prima, hanno selezionato piccoli pezzi di RNA progettati per colpire il PSAV. Questo ha comportato testare quanto fossero efficaci questi pezzi nel riconoscere il virus.
Dopo aver confermato che il nuovo test poteva identificare con precisione il PSAV, hanno garantito che funzionasse bene con diversi campioni, da tamponi di sangue ad altri materiali biologici. Il nuovo metodo mirava a fornire risultati che corrispondessero a quelli ottenuti con i test tradizionali di qPCR, confermandone così l'affidabilità.
Come Funziona il Nuovo Test
Il test sviluppato è un processo semplice in due fasi. Nella prima fase, l'RPA amplifica il materiale genetico del virus se è presente nel campione. Questa fase avviene a una temperatura costante, il che facilita la gestione.
Una volta amplificato il materiale genetico, entra in gioco il CRISPR. Il sistema CRISPR riconosce e contrassegna il materiale virale amplificato e emette un segnale fluorescente. Se il test funziona, l'area di test si illumina, simile a come accende una lampadina quando si preme l'interruttore. Questo segnale visivo è particolarmente utile, poiché consente controlli rapidi senza necessitare di complessi allestimenti di laboratorio.
Testare il Nuovo Metodo
Per garantire che il nuovo test funzioni correttamente, i ricercatori hanno condotto ampi trial. Hanno preparato campioni di controllo positivi contenenti DNA del PSAV e li hanno testati insieme a campioni di altri virus per confermare che il nuovo metodo non stava identificando erroneamente altre infezioni virali come PSA.
I ricercatori hanno anche valutato quanto bene il metodo si comportasse in diverse condizioni, utilizzando vari tipi di campioni che i maiali potrebbero presentare. Hanno persino aggiunto concentrazioni note di DNA del PSAV per vedere se il test potesse rilevarlo in modo affidabile, e così è stato.
Valutazione dell'Efficacia
In questi trial, il nuovo metodo ha dimostrato solide prestazioni. Il test è riuscito a identificare con precisione il PSAV sia in condizioni controllate che in campioni reali prelevati da maiali sospettati di essere infetti. I risultati hanno mostrato un livello impressionante di affidabilità, corrispondente a quelli ottenuti con il qPCR, e mettendo in evidenza quanto potrebbe essere utile questo metodo sul campo.
Perché Questo È Importante
Lo sviluppo di questo nuovo test è cruciale perché fornisce uno strumento essenziale per gli allevatori e i veterinari. In caso di un focolaio di PSA, un test rapido e affidabile può aiutare nella diagnosi precoce e nel controllo. Una diagnosi veloce significa che si possono prendere azioni più rapide per prevenire la diffusione del virus.
Questa innovazione può essere particolarmente vantaggiosa in aree dove le risorse e l'accesso a strutture di laboratorio sono limitati. Abilitando chi si trova in prima linea nell'allevamento dei maiali, questo test potrebbe aiutare a proteggere l'industria dagli effetti devastanti della PSA.
Conclusione
In sintesi, l'aumento della PSA rappresenta una sfida significativa per l'allevamento dei maiali a livello globale, influenzando l'approvvigionamento alimentare e la stabilità economica. Lo sviluppo di un metodo di test semplice ed efficace che combini RPA e CRISPR potrebbe cambiare il modo in cui affrontiamo questa malattia.
Con uno strumento rapido e accurato per diagnosticare la PSA, potremmo vedere una diminuzione dei focolai e un rischio ridotto per le popolazioni suiniche. A volte, ci vuole un po' di creatività e innovazione-come mescolare la scienza con un tocco di umorismo-per superare le sfide. Gli scienziati lavorano continuamente per piegare la curva della diffusione della malattia, rendendo il mondo un posto più sicuro per i nostri amici a quattro zampe e gli allevatori che se ne prendono cura.
Titolo: Rapid identification of African swine fever virus in diagnostic samples using CRISPR-Cas
Estratto: African Swine Fever Virus (ASFV) is a high consequence, highly transmissible pathogen affecting swine causing African Swine Fever (ASF), a devastating disease, with high mortality rates in naive populations. Due to the likelihood of significant economic impacts associated with an ASF outbreak, considerable resources have been allocated in the United States (U.S.) to safeguard the swine industry against this threat. Ongoing outbreaks of ASF in the Dominican Republic and Haiti further threaten U.S. swine due to their proximity and involvement in movement to and from North America. While surveillance programs are ongoing, there are limited point-of-care (POC) tests available during outbreaks that maintain the sensitivity and specificity standards of laboratory testing (e.g., qPCR). However, the recently developed CRISPR-Cas testing systems may provide comparable high-quality results. In a CRISPR-based diagnostic assay, CRISPR effectors can be programmed with CRISPR-RNA (crRNA) to target specific DNA or RNA. Upon target binding, the Cas enzyme undergoes collateral cleavage of nearby fluorescently quenched reporter molecules (ssDNA or ssRNA), which can be detected under blue light or a fluorescence microplate reader. Furthermore, this tool is rapid, simple, cost-effective and can be performed with inexpensive equipment. For these reasons, we sought to develop a low-cost visual detection method for ASFV by employing the recombinase polymerase amplification (RPA)-dependent CRISPR-Cas12a technique that can be utilized in the field as a point-of-care-assay. Our CRISPR-Cas12a assay demonstrated comparable sensitivity and specificity to qPCR, both visually and when quantified using a fluorescent reader. In whole blood samples from ASFV-suspect or ASFV-negative cases, the CRISPR assay achieved a sensitivity of 98.3% (102 DNA copies) and a specificity of 100%. Finally, an assessment of the reaction time constraints indicated that results can be visualized in as little as seven minutes with a peak fluorescence at 40 min (RPA and CRISPR steps). The results of this feasibility assay validation allow for the rapid development of sensitive and specific POC tests that may be used for outbreak response in the future.
Autori: Sekhar Kambakam, Julia Thomas, Suelee Robbe-Austerman, Karthik Shanmuganatham, Rachel Palinski
Ultimo aggiornamento: Dec 30, 2024
Lingua: English
URL di origine: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.12.27.630508
Fonte PDF: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.12.27.630508.full.pdf
Licenza: https://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/
Modifiche: Questa sintesi è stata creata con l'assistenza di AI e potrebbe presentare delle imprecisioni. Per informazioni accurate, consultare i documenti originali collegati qui.
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