Évaluer la diversité génétique de Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis (MTB) est la bactérie responsable de la tuberculose (TB). La recherche sur cette bactérie repose souvent sur sa culture à partir d'échantillons cliniques. Ça consiste à faire pousser la bactérie en labo pour que les scientifiques puissent en avoir suffisamment pour divers tests, comme le Séquençage du génome entier (WGS). Cependant, il y a des inquiétudes que ce processus de culture pourrait limiter la variété génétique de la bactérie.

Quand on cultive des bactéries, certaines souches peuvent mieux se développer que d'autres. Ça veut dire qu'on pourrait passer à côté de certaines variétés génétiques de MTB, surtout celles qui pourraient être liées à la résistance aux médicaments. Si c'est le cas, ça pourrait mener à une mauvaise compréhension de la véritable diversité de la bactérie chez une personne et de comment elle se propage dans la communauté. Séquencer directement la bactérie à partir d'échantillons cliniques, sans passer par la culture, pourrait aider à éviter ces problèmes. Mais cette méthode a ses propres défis, car les échantillons cliniques contiennent de faibles quantités de ADN MTB et sont mélangés avec d'autres ADN de l'hôte et des contaminants.

#Recherche Antérieure

Des études précédentes se sont concentrées sur des façons bon marché et efficaces de séquencer le MTB sans le cultiver. Les chercheurs ont vérifié si les résultats du séquençage direct correspondaient à ceux obtenus à partir d'échantillons cultivés. Mais les résultats ont été mitigés. Certaines études n'ont trouvé pas de différences significatives entre les deux méthodes, tandis que d'autres ont suggéré que la culture réduisait la diversité génétique. Cette incohérence pourrait venir de limitations dans les études, comme se concentrer sur un seul endroit ou ne pas avoir de données de haute qualité pour les séquences sans culture. En plus, le fait de ne pas pouvoir identifier des variants génétiques de faible fréquence complique encore plus les choses.

Donc, il reste flou si la culture affecte vraiment la diversité génétique du MTB. Cette recherche vise à déterminer si la culture reflète la variabilité génétique originale présente dans les échantillons diagnostiques de TB, en particulier les crachats.

#Notre Étude

Dans notre étude, on a rassemblé des échantillons de deux endroits avec différents taux de TB, niveaux de résistance aux médicaments et taux de co-infection par le VIH. On a séquencé des échantillons de crachat et leurs échantillons cultivés associés pour comparer la diversité génétique entre eux. On a développé une méthode qui incluait à la fois le séquençage direct (dWGS) et une méthode de séquençage enrichi (eWGS), selon la quantité de ADN MTB trouvée dans l'échantillon. On a aussi vérifié les sources d'erreurs dans le processus de séquençage pour garantir des résultats fiables.

On a réussi à séquencer 61 paires crachat-culture venant de la Géorgie et du Mozambique. Notre travail visait à clarifier si les résultats des échantillons cultivés reflètent vraiment la diversité des bactéries trouvées dans les échantillons de crachat originaux.

#Sélection des Échantillons

Sur un total initial de 95 paires crachat-culture, on a trouvé que 80 étaient adaptées au séquençage. Dans certains cas, les cultures n'ont pas réussi à se développer, et dans d'autres, les échantillons de crachat se sont révélés négatifs pour le MTB. On a alors catégorisé les échantillons de crachat restants selon la qualité de l'ADN MTB qu'ils contenaient. Une grande partie a subi un séquençage direct, tandis que d'autres nécessitaient une enrichment pour augmenter la quantité de ADN MTB présente.

À travers cette procédure d'enrichissement, on a observé des augmentations notables dans le pourcentage de ADN MTB pour les échantillons qui contenaient à l'origine de faibles quantités. C'était crucial pour obtenir des séquences de haute qualité.

#Évaluation des Échantillons de Crachat

On a évalué la qualité des échantillons de crachat pour le séquençage. Chaque échantillon a reçu un point en fonction de la quantité de ADN MTB détectée via un test qPCR. Ceux avec suffisamment de ADN MTB ont été envoyés au séquençage. Si les échantillons ne remplissaient pas certains seuils, ils étaient considérés comme non adaptés pour une analyse plus approfondie.

En séquençant, on a trouvé un total de 61 échantillons de qualité qui avaient une bonne couverture et profondeur. Ces chiffres indiquaient que notre approche de séquençage était efficace, avec tous les échantillons donnant une couverture significative du génome MTB.

#Analyse des Variants

Pour garantir une analyse précise des variations génétiques, on a comparé les résultats du dWGS, eWGS, et des échantillons cultivés provenant des mêmes cas de TB. Notre analyse nous a permis d'identifier des variants présents dans une méthode mais pas dans d'autres. On a découvert que beaucoup de divergences trouvées dans les échantillons eWGS étaient dues à des erreurs créées pendant le processus de séquençage, spécifiquement à partir d'alignements supplémentaires.

Après avoir exclu ces alignements erronés de notre analyse, on a trouvé un haut niveau d'accord-99-100%-dans les appels de variants entre les différentes méthodes de séquençage. Ça a renforcé notre confiance dans les résultats du séquençage.

#Comparaison de la Diversité Génétique

On a ensuite examiné la diversité génétique entre les échantillons cultivés et les échantillons de crachat. La majorité des variations génétiques, environ 97%, étaient partagées entre les crachats et les cultures. Seulement un petit nombre de variants exclusifs a été trouvé dans un échantillon de crachat ou cultivé. La plupart des paires crachat-culture affichaient des caractéristiques génétiques similaires.

Fait intéressant, on a noté que bien que les méthodes sans culture puissent être utiles pour identifier des SNPs, elles manquent souvent de variants de faible fréquence, surtout ceux avec des fréquences intermédiaires. En gros, la corrélation des fréquences de SNP entre les échantillons de crachat et cultivés était très élevée, ce qui suggère que la culture dépeint fidèlement la diversité génétique de la bactérie.

#Examen d'Autres Ensembles de Données

Pour renforcer nos conclusions, on a élargi notre analyse aux ensembles de données disponibles publiquement provenant de différents endroits. Dans ces ensembles de données, d'autres chercheurs ont rapporté des différences de diversité génétique entre les crachats et les cultures, mais nos analyses ont montré des résultats similaires aux nôtres. La majorité des divergences étaient mineures, renforçant notre affirmation que les échantillons cultivés reflètent généralement la diversité présente dans les échantillons de crachat.

#Classification Phylogénétique et Résistance

On a effectué une classification phylogénétique sur nos échantillons pour déterminer la lignée des souches de MTB. Notre analyse a montré que tous les échantillons correspondaient parfaitement à leurs cultures respectives. On a aussi évalué les profils de résistance aux médicaments et trouvé un accord complet entre les données de résistance dans les échantillons de crachat et de culture.

Nos résultats se sont concentrés sur la présence de mutations spécifiques liées à la résistance aux médicaments. Bien que l'on ait identifié certaines souches avec des variants de résistance connus, on n'a pas trouvé de mutations de résistance à faible fréquence. Ça pourrait signifier que nos résultats sont représentatifs des cas typiques de TB sans complications supplémentaires.

#Conclusions

En résumé, notre recherche met en avant l'efficacité de la culture pour capturer la diversité génétique du MTB présente dans les échantillons de crachat. La haute corrélation dans la présence et la fréquence des SNP entre les échantillons de crachat et cultivés suggère que la culture ne déforme pas significativement la diversité génétique sous-jacente de la bactérie. De plus, notre pipeline bioinformatique sur mesure s'est avéré essentiel pour identifier et corriger les erreurs qui pourraient survenir durant l'analyse.

À travers nos résultats, on milite pour la poursuite de l'utilisation des échantillons cultivés dans la recherche sur la TB, car ils reflètent avec précision la diversité génétique de la bactérie. À l'avenir, des améliorations supplémentaires dans les techniques et méthodologies de séquençage vont enrichir notre compréhension de la diversité du MTB et de ses implications pour le traitement et les diagnostics.