Horloges circadiennes : Expression génique dans le foie de souris

Les Horloges circadiennes chez les mammifères sont des systèmes internes qui régulent les processus biologiques sur un cycle de 24 heures. Ces horloges contrôlent les niveaux de molécules spécifiques, comme l'ARN et les protéines, tout au long de la journée. Au cœur de ces horloges se trouvent des gènes qui influencent diverses fonctions corporelles, comme le sommeil, le métabolisme et la libération d'hormones.

#Le rôle des gènes clés

Deux protéines importantes qui font fonctionner ces horloges circadiennes sont BMAL1 et CLOCK. Elles collaborent pour activer d'autres gènes comme Cry et Per. Les protéines produites par ces gènes inhibent ensuite l'activité de BMAL1 et CLOCK, créant une boucle de rétroaction qui aide à maintenir le rythme de ces processus biologiques.

#Interaction avec la lumière et l'alimentation

Chez les mammifères, il y a plein d'horloges individuelles dans différentes cellules et tissus. Ces horloges sont influencées par la lumière et d'autres signaux, comme les habitudes alimentaires et le jeûne. Par exemple, dans le foie, l'horloge circadienne interagit avec les cycles alimentaires pour gérer l'expression de milliers de gènes importants pour le métabolisme.

#Importance de la régulation circadienne

Les perturbations de l'horloge circadienne, que ce soit à cause de facteurs environnementaux ou de problèmes génétiques, peuvent mener à diverses maladies métaboliques. Donc, comprendre comment ces horloges internes fonctionnent est crucial pour prévenir ces problèmes de santé.

#Avancées dans les techniques de recherche

Un certain nombre d'études se sont concentrées sur la façon dont l'activité des gènes change au fil du temps dans le tissu hépatique des souris. Cependant, beaucoup de ces études ont seulement examiné des gènes individuels ou des parties de gènes à cause de limitations techniques. Changer le focus vers l'analyse de transcrits complets, ou isoformes, pourrait fournir des aperçus plus profonds sur la façon dont les rythmes circadiens affectent l'expression des gènes.

#Importance des isoformes de transcrits

Les isoformes de transcrits sont différentes versions d'un même gène qui peuvent avoir des fonctions distinctes. Elles comprennent des séquences de codage complètes et indiquent où commence la transcription du gène. Comprendre ces isoformes peut montrer comment les gènes produisent différentes protéines qui régulent diverses fonctions corporelles.

#Nouvelle technologie de séquençage

Les récentes avancées dans la technologie de séquençage permettent le séquençage complet des molécules d'ARN, rendant possible l'étude de ces isoformes plus précisément. Cette technologie offre une vue d'ensemble du transcriptome, ou la somme de toutes les molécules d'ARN produites dans une cellule.

#Notre approche de recherche

On a utilisé cette technique de séquençage avancée appelée R2C2 pour examiner comment l'horloge circadienne influence l'expression des gènes au niveau des isoformes dans le foie des souris. Cette méthode nous a permis de collecter un grand nombre de séquences d'ARN précises à différents moments de la journée.

#Configuration expérimentale

Des souris mâles ont été maintenues sur un cycle lumière/obscurité de 12 heures avant d'être placées dans l'obscurité constante. Elles ont été sacrifiées par paires à intervalles réguliers pour collecter des échantillons de foie. Cette configuration nous a permis de suivre les changements dans l'activité des gènes sur un cycle circadien complet.

#Génération et analyse de données

On a créé des bibliothèques de cDNA de longueur entière à partir de l'ARN extrait des foies de souris. On a utilisé une méthode spécifique pour préparer ces échantillons pour le séquençage, en veillant à capturer une large gamme de tailles de transcrits. En séquençant les échantillons avec une technologie avancée, on a généré des millions de lectures d'ARN précises.

#Quantification de l'activité des gènes

Pour confirmer que notre méthode pouvait détecter efficacement les changements dans l'activité des gènes, on a analysé des gènes circadiens connus. On a constaté que les niveaux d'expression de ces gènes oscillaient comme prévu au cours de notre expérience. Nos résultats étaient en forte accord avec des études précédentes utilisant différentes méthodes de séquençage.

#Analyse à l'échelle du génome

Ensuite, on a élargi notre analyse pour examiner le comportement de tous les gènes de notre jeu de données. En utilisant des outils computationnels spécialisés, on a trouvé plus de mille gènes qui affichaient des motifs d'expression oscillants. Ces motifs étaient cohérents avec les rythmes circadiens connus et correspondaient à ceux trouvés dans d'autres études.

#Transition vers l'analyse d'isoformes

Le séquençage R2C2 permet non seulement une analyse au niveau des gènes, mais offre aussi une opportunité unique d'explorer les isoformes de transcrits. Cela signifie qu'on pouvait analyser l'ensemble des changements d'expression des gènes, y compris les variantes spécifiques de chaque gène.

#Identification et quantification des isoformes

En utilisant nos données d'ARN, on a pu identifier et quantifier des milliers d'isoformes différentes. Cela incluait beaucoup qui n'avaient pas été auparavant annotées dans les bases de données existantes. Notre analyse a révélé qu'une part significative des isoformes était peu exprimée.

#Détection des oscillations des isoformes

On a également exploré comment ces isoformes changeaient au cours du cycle circadien. Plus de mille isoformes ont montré des motifs oscillants. Fait intéressant, beaucoup de gènes produisaient à la fois des isoformes oscillantes et non oscillantes. Ce mélange peut affecter les motifs d'expression globaux au niveau des gènes.

#Analyse des séquences de codage

Ensuite, on s'est concentré sur les séquences de codage, qui sont des segments d'ARN fournissant des instructions pour fabriquer des protéines. On a combiné les données des différentes isoformes pour évaluer l'expression des séquences de codage individuelles. Cela a permis d’obtenir une image plus claire de la façon dont les séquences de codage se comportent tout au long du cycle circadien.

#Observation des oscillations des séquences de codage

On a identifié plusieurs séquences de codage qui oscillaient tout au long de la journée. La majorité de celles-ci étaient associées à des gènes connus pour exhiber un comportement circadien. On a aussi analysé les relations entre ces séquences de codage et leurs gènes respectifs pour fournir des aperçus supplémentaires.

#Investiguer les sites de début de transcription

Les sites de début de transcription (TSS) sont cruciaux pour comprendre où commence l'expression des gènes. On a utilisé nos données pour identifier de nombreux TSS et évaluer leur activité au cours du rythme circadien. Cela nous a aidés à discerner comment l'initiation de la transcription pourrait être régulée tout au long de la journée.

#Validation des sites de début de transcription

En utilisant des données de référence disponibles, on a confirmé que nos TSS identifiés correspondaient bien aux marqueurs connus de transcription active. Cette validation nous a permis d’avancer dans l'investigation des oscillations des TSS.

#Examen des oscillations des TSS

On a trouvé de nombreux TSS qui affichaient des motifs oscillants, qu'on a associés à des gènes spécifiques. Ces oscillations reflétaient souvent le comportement des marqueurs épigénétiques, indiquant une relation entre la transcription et ces éléments régulateurs.

#Comprendre l'activité des Facteurs de transcription

Les facteurs de transcription (TF) sont des protéines qui régulent l'expression des gènes. On visait à comprendre comment ces facteurs interagissaient avec les TSS oscillants pour affecter l'activité de transcription. En analysant les données de liaison des TF existantes, on a pu voir des motifs d'activité des TF tout au long du cycle circadien.

#Enrichissement des facteurs de transcription

On a observé que certains facteurs de transcription, particulièrement ceux impliqués dans la machinerie circadienne de base, montraient une superposition significative avec les TSS oscillants. Cela indique qu'ils jouent un rôle crucial dans la régulation de l'expression des gènes à différents moments du cycle de 24 heures.

#Conclusion

Grâce à une technologie de séquençage innovante et une analyse de données complète, on a obtenu des aperçus précieux sur la dynamique de l'expression des gènes circadiens dans le foie des souris. Notre approche nous a permis de découvrir les rôles des isoformes, des séquences de codage et des TSS, offrant une compréhension plus détaillée de la façon dont les processus biologiques fluctuent au fil du temps. Cette étude met en évidence le potentiel de futures recherches pour explorer plus en profondeur les nuances de la biologie circadienne, ouvrant la voie à des découvertes en matière de santé et de gestion des maladies.

#Directions futures

Bien que notre étude ait produit des résultats significatifs, il y a des défis techniques qui doivent être abordés dans les recherches futures. Augmenter la quantité de lectures collectées améliorera la détection des isoformes peu exprimées, et utiliser des techniques avancées pourrait améliorer la capacité à capturer des transcrits d'ARN plus longs.

En continuant à affiner ces méthodes et en réalisant des études similaires dans divers tissus, les chercheurs peuvent développer une compréhension plus complète des rythmes circadiens et de leurs implications pour la santé globale.

#Méthodes

Extraction d'ARN et synthèse de cDNA

L'ARN total a été extrait d'échantillons de foie congelés en utilisant un protocole standard. Pour la synthèse de cDNA, l'ARN a été mélangé avec les composants nécessaires pour la transcription inverse, suivi de la synthèse de la seconde chaîne et de l'amplification via PCR.

Préparation de bibliothèques R2C2

Les bibliothèques pour le séquençage ont été préparées en utilisant une méthode spécifique qui circularise le cDNA, permettant une précision de séquençage améliorée. La sélection de taille a veillé à ce qu'une large gamme de longueurs de transcrits soit incluse dans les bibliothèques finales.

Séquençage ONT et traitement des données

On a effectué le séquençage sur des cellules de flux spécialisées et traité les données résultantes en utilisant des outils bioinformatiques avancés. Cela a impliqué l'alignement sur les génomes de référence et la quantification de l'expression des gènes à différents niveaux.

Analyse des données et visualisation

Notre analyse des données de lectures fournies des aperçus sur les comportements des gènes, des isoformes, des séquences de codage et des sites de début de transcription. Les outils de visualisation ont aidé à clarifier les relations entre ces éléments au cours du cycle circadien.

En fournissant ces méthodes et résultats détaillés, on vise à rendre notre étude accessible à un large public, encourageant davantage d'exploration et de recherche dans la biologie circadienne.