La interferencia de ARN revela genes clave en la meiosis femenina

Las pantallas genéticas son herramientas importantes para averiguar qué genes se necesitan para diferentes procesos biológicos. Los científicos han usado estas pantallas para estudiar problemas con la meiosis femenina, que es un tipo especial de división celular. Algunos investigadores utilizaron mutantes encontrados en poblaciones naturales, mientras que otros crearon mutaciones usando químicos o métodos especiales que insertan nuevos genes en los Cromosomas. La mayoría de estas pantallas se enfocaron en hacer que los cromosomas mutantes fueran homocigotos, lo que significa que tenían dos copias idénticas de un gen. Este método fue útil para encontrar mutaciones de genes recesivos que llevaban a problemas como la producción de demasiados descendientes anormales debido a la no disyunción meiótica.

Aunque fue efectivo, este enfoque tenía limitaciones. Requerir que las mutantes femeninas fueran viables y fértiles significaba que mutaciones letales o que causaban esterilidad no podían ser detectadas. Además, solo identificaba mutaciones que causaban específicamente no disyunción, pasando por alto otros problemas potenciales. Una mejora vino con el uso de una técnica que crea clones germinales homocigotos a través de un proceso llamado recombinación mitótica. Este método permitió a los investigadores hacer específicos cromosomas homocigotos en células germinales, mientras que los mantenían heterocigotos en el resto del cuerpo, permitiéndoles estudiar mutaciones que normalmente serían letales.

Otro avance involucró el uso de la Interferencia de ARN (RNAi) para reducir la actividad de genes específicos de manera dirigida. RNAi aprovecha un mecanismo de defensa natural en las células, introduciendo una secuencia que coincide con el gen objetivo. Esto lleva a la degradación del ARN mensajero (mRNA) de ese gen, reduciendo efectivamente sus niveles. En muchos casos, esto puede reducir la expresión génica en un 80 a 95%. En las moscas de la fruta, los científicos han creado colecciones de construcciones de RNAi que se pueden activar en tejidos específicos, permitiéndoles examinar los efectos de mutaciones que normalmente serían letales.

Usando este método, los investigadores en nuestro laboratorio han estado mirando dos eventos clave que ocurren durante las primeras etapas de la meiosis femenina. El primero es la congregación de cromosomas, que se refiere a cómo los cromosomas se mueven y alinean correctamente durante la división celular. Drosophila, o moscas de la fruta, tienen su oogénesis dividida en 14 etapas basadas en su desarrollo. La transición de la etapa 12 a la 13 marca el final de una fase de división celular y el comienzo de otra. Durante este tiempo, se forman estructuras del huso y los cromosomas comienzan a separarse.

Sin puntos de intercambio, conocidos como quiasmas, los cromosomas sin intercambio aún permanecen conectados. Estos cromosomas se mueven hacia lados opuestos del huso. Eventualmente, deberían juntarse en la placa metafásica para formar una estructura compacta antes de la división celular. Si esta congregación no sucede correctamente, pueden surgir problemas como la aneuploidía, llevando a gametos con números incorrectos de cromosomas.

#Estudiando los Filamentos Ooplásmicos

El segundo enfoque de nuestra investigación es entender los filamentos ooplásmicos, que fueron observados por primera vez cuando ciertas proteínas se localizaron en ellos. Estos filamentos aparecen poco después de la ruptura del vesículo germinal y parecen desensamblarse poco después de que el óvulo es activado y fertilizado. Algunas proteínas muestran comportamiento dinámico, uniéndose a estos filamentos en respuesta a cambios ambientales.

Los investigadores usaron técnicas de imagen especiales para visualizar estos filamentos y notaron que tienen una estructura única. Sin embargo, a pesar de intentar identificar las proteínas que forman estos filamentos, sigue sin estar claro de qué están hechos exactamente, lo que complica entender sus roles en los procesos meióticos.

En nuestro laboratorio, hemos llevado a cabo una pantalla citológica para probar una colección de construcciones de RNAi para encontrar genes esenciales para estos dos procesos en la meiosis femenina. Nos enfocamos en analizar huevos no fertilizados para identificar genes que podrían haber causado letalidad si se hubieran estudiado de la manera tradicional. Esto involucró cruzar machos de un stock específico de RNAi con hembras que expresaban controladores específicos para inducir RNAi para genes objetivos particulares. Luego, se examinaron los ovocitos bajo un microscopio para identificar cualquier defecto en su desarrollo.

El defecto de congregación llevaría a múltiples masas de cromosomas, mientras que los defectos en los filamentos mostrarían una ausencia completa de los filamentos o cambios importantes en su estructura. Dado que pantallas de RNAi anteriores habían identificado varios genes que llevaban a un fallo en la formación de huevos, volvimos a probar esas líneas con un controlador diferente que se activa más tarde en el desarrollo del huevo.

#Proceso de Selección

Screening más de 1,400 construcciones de RNAi, descubrimos genes conocidos y desconocidos relacionados con la meiosis. Muchos de los genes que probamos no habían sido examinados anteriormente, y reconocimos que mutantes meióticos conocidos anteriormente podrían servir como controles valiosos en nuestro análisis. De las construcciones probadas, registramos muchos resultados negativos; sin embargo, identificamos con éxito varias líneas con defectos interesantes.

El proceso de selección nos permitió separar las líneas en varias categorías. La primera categoría incluía resultados negativos, donde no se notaron defectos. La segunda categoría incluía líneas que no se podían probar, lo que significa que no produjeron ovocitos maduros. La tercera categoría incluía líneas que no exhibieron defectos en los ovocitos al ser probadas. Finalmente, identificamos una categoría de líneas con hallazgos específicos que mostraban defectos, lo que nos interesa estudiar más a fondo.

#Características de los Defectos de Congregación

El defecto de congregación que observamos involucró a los cromosomas meióticos que no lograron juntarse en una sola masa, resultando en múltiples masas de ADN en la etapa donde los huevos estaban detenidos antes de la división. Notamos problemas como la degradación de cromosomas meióticos o estructuras anormales, como arreglos incorrectos de heterocromatina.

#Metodología de Selección

Para facilitar nuestra selección, usamos un enfoque sistemático. Pedimos líneas de RNAi y las cruzamos con stocks de prueba apropiados para evaluar fenotipos. Después de los cruces, diseccionamos los ovarios, los fijamos y tiñamos las muestras para observación bajo un microscopio. El proceso optimizado nos permitió analizar muchas muestras de manera eficiente.

Nuestros resultados indicaron que muchos de los genes identificados eran vitales para la meiosis, con un número significativo de líneas siendo estériles o semi-estériles cuando se indujo RNAi. Esto confirmó nuestra hipótesis de que los métodos de selección tradicionales podrían haber pasado por alto muchos genes críticos debido a sus efectos letales o de esterilidad.

#Resultados de la Selección

Categorizar los resultados de nuestros esfuerzos de selección en grupos basados en la presencia o ausencia de defectos. Muchas líneas produjeron ovocitos puntuables sin defectos, mientras que otras cayeron en la categoría de no probables. Un menor número mostró defectos claros en los procesos celulares que estábamos estudiando.

Entre los hallazgos que identificamos, observamos varios genes previamente no caracterizados, ampliando nuestra comprensión del paisaje genético relacionado con la meiosis femenina.

#Análisis de Ontología de Genes

Para analizar nuestros resultados más a fondo, realizamos un análisis de Ontología de Genes para ver a qué procesos biológicos pertenecen los genes. Encontramos que los genes variaban ampliamente en función, con muchos asociados con el metabolismo del ARN. Algunos genes estaban implicados en procesos esenciales para eventos meióticos y del ciclo celular, mientras que otros desempeñaban roles críticos en la organización de componentes celulares.

#Conclusión

Este estudio destacó la utilidad de usar RNAi como una herramienta poderosa para identificar genes importantes involucrados en la meiosis femenina. Al enfocarnos en la Línea germinal, identificamos con éxito candidatos para futuras investigaciones. Si bien encontramos varios desafíos con la validación y posibles efectos fuera de objetivo, las ideas obtenidas informarán futuras investigaciones y ayudarán a descubrir los mecanismos subyacentes de la meiosis.

Nuestros hallazgos abren puertas para una exploración continua de los factores genéticos en juego durante la meiosis, particularmente en la identificación de componentes estructurales esenciales para el correcto funcionamiento celular en el Oocito en desarrollo. Los hallazgos y categorías establecidas a través de esta selección proporcionarán una base para futuros estudios en el campo, que avanzará nuestra comprensión de la complejidad de la meiosis y su regulación genética.