Producción de L-asparaginasa a partir de E. coli para el tratamiento del cáncer

L-Asparaginasa es una enzima que trabaja con el aminoácido L-asparagina. Se usa principalmente como tratamiento para ciertos tipos de cáncer, especialmente leucemia y linfoma. De hecho, tiene un papel importante en la demanda global de tratamientos contra el cáncer. L-asparaginasa a menudo se combina con otros medicamentos, como vincristina y glucocorticoides, para aumentar su efectividad. Hay dos tipos principales de L-asparaginasa: extracelular e intracelular. Estas Enzimas se encuentran en varios organismos, como animales, bacterias y plantas, pero los humanos no las producen.

L-asparagina es esencial tanto para las células sanas como para las células cancerosas. Las células cancerosas dependen de L-asparagina del cuerpo porque no pueden producirla. Cuando L-asparagina se agota por la acción de la L-asparaginasa, las células cancerosas pierden un nutriente vital para su crecimiento, lo que puede llevar a su muerte. Las células normales no se ven afectadas por la L-asparaginasa porque pueden producir su propia L-asparagina según lo necesiten.

Uno de los beneficios de la L-asparaginasa es que es no tóxica y se descompone fácilmente en el medio ambiente, lo que la hace segura para su uso. Las principales fuentes de L-asparaginasa son ciertas bacterias, en particular Escherichia coli y especies de Erwinia. Estas bacterias se han utilizado en entornos clínicos para tratar efectivamente la leucemia linfoblástica debido a su fuerte interacción con el sustrato sobre el que actúan.

Escherichia coli (E. Coli) es un tipo de bacteria que vive en los intestinos de animales de sangre caliente. Aunque la mayoría de las cepas de E. coli son inofensivas, algunas pueden causar enfermedades graves, como intoxicaciones alimentarias. Las cepas inofensivas ayudan en la digestión al producir vitamina K y prevenir que las bacterias dañinas se asienten en el intestino. Los científicos a menudo usan agar EMB, un medio de cultivo especial, para aislar E. coli porque es selectivo para bacterias gramnegativas, lo que facilita la identificación de este organismo.

#Recolección de Muestras y Trabajo de Laboratorio

En un estudio reciente, se recolectaron muestras del área de Gubriye, específicamente del río Wabe y aguas residuales de una cafetería en la Universidad de Wolkite. Estas muestras fueron transportadas al laboratorio de Biotecnología Molecular de la universidad y se almacenaron en un ambiente fresco hasta que estuvieron listas para su uso.

Para identificar E. coli en estas muestras, los investigadores estimaron el número de colonias, su color y tamaño. Prepararon una serie de tubos de ensayo estériles, añadieron agua destilada y diluyeron las muestras. Después de mezclar las muestras, las inocularon en placas de agar Eosin Metileno Azul, que se usan para cultivar E. coli. Las placas se incubaron durante 24 horas, permitiendo que las colonias se desarrollaran. Una vez que las colonias fueron visibles, los investigadores utilizaron un método llamado método de placa extendida para aislar aún más las colonias para pruebas.

Para confirmar la identidad de las colonias de E. coli, los investigadores realizaron varias pruebas bioquímicas. Estas incluyeron pruebas como IMViC, TSI y catalasa, que ayudan a identificar características específicas de las bacterias. Los resultados mostraron que la mayoría de las pruebas fueron positivas para E. coli, confirmando su presencia.

#Producción de L-Asparaginasa

Después de identificar los aislamientos de E. coli, los investigadores se enfocaron en su capacidad para producir L-asparaginasa. Colocaron los aislamientos en placas de agar especiales y dividieron esas placas en secciones. Una placa sirvió como control para asegurar pruebas precisas. Los investigadores incubaron las placas para ver cuáles aislamientos producían L-asparaginasa.

Para probar la producción de enzimas, los investigadores prepararon un medio de producción con ingredientes específicos como NaCl, maltosa y ácido L-aspartico. Mantuvieron un pH adecuado y esterilizaron el medio para su uso seguro. Después de añadir las bacterias y permitirles crecer, los investigadores midieron la densidad óptica (OD) de los cultivos para monitorear el crecimiento y la actividad enzimática.

Mientras tanto, también recolectaron muestras del medio de producción usando una centrífuga para separar la enzima de los restos celulares. El líquido que contenía la enzima se almacenó para pruebas posteriores, mientras que la parte sólida se desechó.

#Pruebas de Actividad Enzimática

Para determinar la efectividad de la L-asparaginasa, los investigadores realizaron una prueba de actividad enzimática. Usaron un medio de agar especial que cambia de color en respuesta a cambios de pH. Cuando la enzima trabaja, descompone la L-asparagina, lo que lleva a un aumento de pH, causando que el medio cambie de color de naranja a rosa alrededor de los pozos donde se añadió la enzima. El tamaño de la zona rosa indica el nivel de actividad enzimática.

En este estudio, se examinó una variedad de aislamientos de E. coli por su capacidad para producir L-asparaginasa. De los 14 aislamientos probados, 11 provenían de las aguas residuales de la cafetería, mientras que 3 se obtuvieron del agua del río. Los investigadores encontraron que E. coli de las aguas residuales de la cafetería mostraron una capacidad más fuerte para producir L-asparaginasa.

El estudio también destacó la importancia del tiempo de incubación en la producción de enzimas. Los resultados mostraron que un período de incubación más prolongado condujo a una mayor actividad enzimática.

#Confirmación Genética de la Producción de L-Asparaginasa

Para confirmar aún más la capacidad de los aislamientos de E. coli para producir L-asparaginasa, los investigadores utilizaron un método llamado PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Esta técnica permite a los científicos amplificar segmentos de ADN, lo que les permite encontrar genes específicos asociados con la producción de L-asparaginasa. Al extraer ADN de los aislamientos bacterianos y usar cebadores específicos diseñados para un gen que codifica L-asparaginasa, los investigadores pudieron confirmar su presencia en las muestras.

Los resultados de la PCR mostraron una banda clara en el tamaño esperado, indicando que alrededor del 50% de los aislamientos podrían potencialmente producir L-asparaginasa. Esta confirmación es crucial porque ayuda a identificar qué cepas se pueden usar para aplicaciones terapéuticas.

#Conclusión

L-asparaginasa es una enzima significativa con usos esenciales en medicina, particularmente en el tratamiento de ciertos cánceres como la leucemia. La investigación muestra que E. coli de las aguas residuales de la cafetería en la Universidad de Wolkite es una fuente prometedora para producir esta enzima. El estudio encontró que estos aislamientos bacterianos demostraron una mayor capacidad para la producción de L-asparaginasa en comparación con los del río.

Los resultados indican que usar aguas residuales de cafeterías podría proporcionar una fuente sostenible de bacterias productoras de L-asparaginasa. A medida que avanza la investigación en esta área, podría haber más oportunidades para encontrar nuevas y efectivas enzimas para diversas aplicaciones, particularmente en el tratamiento del cáncer. El trabajo continuo en el campo de la biología molecular y la biotecnología puede conducir al desarrollo de mejores métodos para la producción de enzimas, beneficiando en última instancia tanto a la medicina como a la industria.